运动疲劳大鼠心肌细胞L型钙通道生物物理特性的研究

1、运动疲劳大鼠心肌细胞L型钙通道生物物理特性的研究    2012-03-09     论文导读:研究运动疲劳对大鼠心肌细胞L-型钙通道电流及生物物理学特性的影响,证明L-型钙通道直接参与到运动疲劳导致的细胞内钙浓度变化中。方法:48只大鼠雌雄不拘,随机分成对照组和运动疲劳组。采用连续15天游泳耐力训练方法建立运动疲劳大鼠模型;应用膜片钳技术检测.    研究运动疲劳对大鼠心肌细胞L-型钙通道电流及生物物理学特性的影响,证明L-型钙通道直接参与到运动疲劳导致的细胞内钙浓度变化中

2、。方法:48只大鼠雌雄不拘,随机分成对照组和运动疲劳组。采用连续15天游泳耐力训练方法建立运动疲劳大鼠模型;应用膜片钳技术检测运动疲劳对大鼠心肌细胞L-型钙通道电流的影响。结果:运动疲劳大鼠全细胞L-型钙电流峰值(IpeakCaL)显著增加:全细胞IpeakCaL电流从-470±11.73 pA变化到- 819.90±10.78 pA, n= 8,P< 0.05,运动性疲劳组较对照组增幅74.60%;2)膜片钳技术检测L-型钙电流的激活和失活通道动力学特性:运动疲劳模型组大鼠心肌细胞的L-型钙电流的失活曲线右移,而激活曲线与对照组相比没有变化。结论:运动疲劳引起大鼠L

3、-型钙通道特性改变,使得钙电流增强,导致心肌细胞内钙平衡调节紊乱。运动性疲劳指机体在生理过程中不能继续在特定水平上进行或整个机体不能维持预定的运动强度。运动性疲劳产生机制方面的研究,是当前体育科学中面对的重要课题,虽对此进行了广泛而深入的研究,但导致运动疲劳的生理机制是一个极其复杂的问题,对于运动疲劳产生的原因以及其中的相关机制的研究仍存在许多争议,并且存在许多假说,如中枢神经疲劳学说、能量衰竭学说、神经-肌肉疲劳学说、代谢产物堆积学说、氧自由基-脂质过氧化学说、钙离子代谢紊乱学说、体温调节失衡学说等等,其中,离子代谢紊乱机制在运动性疲劳中的研究越来越受到人们的重视,而钙离子平衡紊乱的研究最为

4、重要。此48外,运动性疲劳对心脏功能的影响虽有所研究,但其影响作用及机制仍然不清楚,尤其是在分子、细胞水平上对心肌细胞内钙离子稳态变化的研究没有报道。因此,本研究拟通过膜片钳技术探索运动疲劳对心肌细胞L-型钙通道电流及生物物理学特性激活失活曲线的影响,探索运动疲劳与钙通道的关系,证明L-型钙通道直接参与到运动疲劳导致的细胞内钙浓度变化中,导致心肌细胞发生钙超载,造成心肌损伤。材料与方法：验动物Wistar大鼠48只(购自吉林大学基础医学院实验动物中心),体重220 g±25 g,雌雄不拘,随机分为运动疲劳组和对照组,每组24只,自由摄食,饲养环境温度19±4,相对湿度(50

5、±10)%。仪器设备与试剂仪器设备: L-型钙通道离子电流测定使用膜片钳系统(德国进口HEKA公司EPC-10)。试剂:胶原酶型,美国Sigma公司;牛血清白蛋白,博越生物公司;尼莫地平,美国Sigma公司。标准溶液:KraftBruhe液;L-型钙通道电极内液;L-型钙通道细胞外液。实验方法：运动疲劳模型的制备对大鼠进行15天游泳力竭训练,实验水深40 cm±5cm,水温30±2,前10天每天1次,每次3 h训练,后5天每天2次,每次3 h训练。力竭阶段标准为大鼠沉入水底并且3 s内无力返回水面,此时及时捞起,休息2 min后继续游泳,并完成规定的训练时间。运动

6、疲劳模型制备如下:每12只大鼠为1组,编号,第1天开始将编号为1的大鼠放入水池中进行游泳训练,第2天放入1号及2号大鼠,第3天放入1、2、3号大鼠,依次类推,到第12天加入编号为12的大鼠,共同游泳训练至规定天数,该组大鼠疲劳模型建立完毕后,进行下一组疲劳模型建立实验。取样相应编号的大鼠在其第15天的游泳训练近结束时,当大鼠出现沉入水底无力返回水面即力竭状态下,立即取出该运动疲劳大鼠模型,不予任何休息恢复,即刻颈部脱臼处死,迅速开胸取心,采用Langendorff离体灌流分离心肌细胞。大鼠心室肌细胞分离采用Langendorff法离体灌流心脏,大鼠颈部脱臼处死,迅速开胸取出心脏,置于4含Ca2

7、+台氏液清洗修剪,经主动脉将心脏悬挂于Langendorff离体灌流装置上,由主动脉进行逆向灌流,灌流液保持37、通入95%O2+5%CO2混合气体。首先用含钙台式液灌流心脏复跳,泵出心腔内残留血液,更换为无钙台氏液灌流至心脏停止跳动,用含0.16 mg/ml型胶原酶和0.16 mg/ml牛血清白蛋白的无钙台氏液60 ml反复灌流心脏至心肌消化完全。消化结束后,剪下心室,在KB液(g/L:KOH 3.928,L-谷氨酸7.357,KCl 2.982,牛磺酸2.503,KH2PO42.722,MgCl2·6H2O 0. 601,葡萄糖1. 981, HEPES 2. 383,EGTA

8、0.19,KOH调pH值至7.4)中剪块、吹打,镜检含80%以上单个杆状细胞后,置于KB液中4保存。运动疲劳是运动训练过程的一个重要的问题,但对于运动疲劳产生的原因以及其中的相关机制的研究仍存在许多争议。运动疲劳对心血管系统的影响方面,现认为在运动过程中,心脏提供的血流量已满足不了工作肌肉对氧和营养物质及运走过多代谢产物的需求6,其中由于运动性疲劳而导致的心肌细胞钙离子平衡的紊乱是对心肌损伤中甚为重要的环节。Ca2+在维持身体结构和细胞功能方面发挥着重要作用,几乎体内各种细胞功能均与钙离子调节有关。Ca2+活泼的特性使其容易结合细胞内的各种缓冲位点,这些位点通过结合肌钙蛋白、收钙素、钙调蛋白和

9、ATP等物质11,进而发挥重要的生理功能,所以,细胞内钙离子是调节信号转导和其他细胞生理过程重要的第二信使。而在心肌细胞中,游离钙作为偶联因子诱发心肌细胞兴奋与收缩偶联,进而产生心肌收缩,同时,胞内钙对增强心肌收缩力及收缩速率方面有着重要的作用,因此,不管心肌外部50体育科学2011年(第31卷)第11期的调节机制多复杂,最后都可以归结为细胞内钙离子浓度的调节5。近年来,运动性疲劳中Ca2+在心脏的代谢已受到重视。以往的研究认为,Ca2+在运动性疲劳中起着至关重要的作用,尤其是其对线粒体膜结构以及功能的影响方面。运动性状态下心肌线粒体的结构和功能发生了明显变化,这些变化可能是引起疲劳状态下心肌

10、损伤的主要原因,而线粒体的这种损伤也与细胞内钙离子有直接关系。细胞以及线粒体内的钙聚集严重影响细胞正常功能,导致细胞产生程序性死亡(凋亡),细胞内钙超载常作为细胞结构损伤的特征,线粒体内的钙代谢紊乱超载将造成细胞不可逆损害。所以,Ca2+在运动性疲劳中起着重要的作用,有可能是其产生的一个中枢机制,即胞浆内钙超载、线粒体里钙聚集是造成力竭损伤的主因。而关于心肌细胞胞浆内钙超载机制研究甚少。心肌细胞胞浆内钙浓度的增加主要是通过肌质网内的钙离子释放或由细胞膜上的钙离子通道进入的两种方式实现的。因此,在本研究中,我们通过膜片钳技术检测了正常大鼠和运动疲劳大鼠心肌细胞膜L-型钙通道电流的变化,以及运动疲

11、劳后大鼠心肌细胞膜L-型钙通道生物学特性的改变,通过对于运动疲劳后钙通道的研究,揭示导致细胞内Ca2+增多、造成细胞内钙超载、最终使心肌细胞内Ca2+平衡调节紊乱的原因。我们的研究发现:1)运动性疲劳大鼠心肌细胞L-型钙通道ICaL峰电流的显著增强:全细胞ICaL峰电流从-470±11.73 pA/pF变化到-819.90±10.78 pA/pF,比对照组增加了74.60%,表明与正常细胞相比,运动疲劳后的心肌细胞单位时间内通过细胞膜L-型钙通道进入细胞内的Ca2+数量显著增加,造成细胞内钙超载;2)通过对运动疲劳大鼠的L-型钙通道的动力学研究发现,该组大鼠L型-钙通道失活

12、曲线发生了右移,激活曲线无变化,表明运动疲劳模型组的大鼠L-型钙通道失活过程更难,运动疲劳抑制了钙通道的失活过程,造成钙通道关闭延迟,单位时间内经由通道进入细胞的钙离子数量增加,这种钙通道生物物理学特性的改变导致细胞内钙调节的紊乱。本研究首次直接观察到了由于力竭运动而导致大鼠心肌细胞膜L-型钙通道电流增强作用,证实了运动性疲劳产生的细胞内钙超载部分直接因素是通过改变细胞膜L-型钙通道生物物理学特性而实现的,揭示了运动疲劳状态下细胞内钙离子浓度升高的分子、细胞生理学机制,对于解释力竭造成的心肌细胞损伤有重要意义,为在体育运动训练中,选择合适的训练强度提高运动成绩,提供理论依据。结论作者研究了力竭

13、运动对大鼠心肌细胞L-型钙通道电流的变化及钙通道生物物理学特性的改变,发现2周的力竭运动可导致心肌L-型钙通道电流振幅增强,激活曲线无变化,失活曲线显著右移,证明了L-型钙通道电流及生物物理学特性改变是运动疲劳导致细胞内钙超载的直接原因之一的分子、细胞生理学机制,由此产生细胞内钙超载、钙平衡调节紊乱。在介绍持续农业模式、物理农业、农业物理学和生物物理学基本概念和相互关系的基础上,结合我国农业生物物理学的发展现状,提出在高等农业院校建设生物物理研究所的创新人才培养目标;根据高等农业院校的专业实际,突出生物学专业和物理学的关系,并由此引出生物物理研究机构在生物类专业本科生和研究生创新思维和创新能力

14、培养中的作用;结合国家农业发展规划和农业生物物理发展趋势,对农业生物物理研究所和农业生物物理学科的发展对持续农业模式发展的影响进行了展望。以化学肥料和化学农药为代表的"化学农业"虽极大地提高了农作物产量,但却不可避免地导致了土质退化、环境恶化、生态破坏、食品安全等问题。为确保人类社会的可持续发展,有识之士逐渐提出可持续发展农业模式:"物理农业"和"生物朱杰,等:生物物理研究机构在生物类专业创新人才培养中的作用工程"。目前,我国的物理农业和农业物理技术发展却很缓慢,水平也较低,这与我国农业生物物理的发展水平较低密切相关。生物物理学是应用

15、物理学的概念、理论和方法研究生物大分子、细胞(器)、组织甚至器官结构与功能的关系、生命过程中的物理学规律以及物理因素对生物系统作用机制的科学,是物理学和生物学相结合产生的一门交叉学科,它的发展对生物学从定性的观察描述逐步走向精确(定量)科学的发展起着关键作用。而当前制约我国农业生物物理快速、深入发展的主要因素是科学研究的三个分散性:研究队伍分散性,研究内容分散性,成果交流分散性。而建立专门的生物物理研究机构,则可集中优秀科技人才和优势实验设备,在宏观统筹下集中力量对一些关键和重大问题进行攻关,也有利于研究成果的交流。在高等农业院校建立生物物理研究机构还同时承担着生物类专业本科生实验教学、研究生

16、工程训练及课题研究的作用,在培养生物类专业创新型本科人才和研究生方面起着关键作用。本文主要探讨生物物理研究机构在高等农业院校生物类专业创新型本科生与研究生培养方面所起的作用。研究所发展目标生物物理研究所是现代农学、生物学和物理学等交叉科学的重要研究基地和人才培养基地。研究所瞄准21世纪农业生物物理学中具有基础性、前沿性的重大理论和工程技术难题,联系与人类生存与健康相关的重大需求,发挥多学科交叉综合的优势,充分利用国家政策与科研基金的支持,以农业科学与工程研究中的农业增产增质、农产品的贮藏与保鲜、农业信息的检测与加工、农业虫害的发现与防治、农业环境的保护与治理等问题为核心,大力开展农业生物过程中

17、有关物质运输、能量转换和信息传递等关键领域的一系列原创性研究工作,力图开发出"两优一高"的农产品,为我国持续农业的现代化做出有力贡献。与此同时,重点关注研究所在本科创新人才和研究生专业人才的培养上面,并力图将人才培养同科学研究统一起来,在培养农业生物物理专业人才的基础上,逐步增强我国的农业生物物理学科研实力和学术影响力。实验条件建设实验条件建设主要包含了科研场所和仪器设备的建设,是研究机构进行科学项目研究、科技创新与开发、本科生创新教育与研究生科研培训的必要设施。首先,根据学校科研平台的设备状况,结合研究机构的发展规划与现有科研人员的研究水平和兴趣点,制定详细的仪器购置计划

18、;对能够保证研究机构特点的大型仪器给予重点考虑,关注高端仪器的时效性和共享性,极力避免大型高端设备重复购置,应充分考虑到校级平台和周围高校与科研院所科研平台的共享可能性。对于小型、廉价、有较高利用率的制备型和分析型仪器则应尽可能地配置齐全,也可以考虑校内、院内和所内重复购置,甚至可以根据实际需要在研究所和课题组内制定多台的购置计划,以便课题前期基础试验的顺利进行。另外,对于大型高精尖仪器设备应着重考虑国际知名品牌的先进产品,而小型的常规仪器可考虑国内知名的厂家提供的产品,但不管是什么样的仪器设备,购买时一定要考虑到产品的售后服务和技术保障。其次,需对实验室空间进行合理布局和分配。比如,我所根据

19、生物物理学科特点和科研人员的研究兴趣,主要建设4个研究室:环境与辐射生物物理研究室、分子与细胞生物物理研究室、生物物理新技术新方法研究室、理论生物物理研究室。其中,前3个研究室需要大型仪器设备的支撑,主要承担所内和校内的实验性课题研究、研究生学位论文实验及高年级本科生的专业实验教学等。环境与辐射生物物理研究室是研究所的主题性基础实验室,物理环境的调控装置在该室的核心地位十分明显,各种类型的高压电场电源、高强度脉冲磁场源、超声波发生器、同位素核辐射源和激光发生器等应具有一定建设规模。分子与细胞生物物理研究室和生物物理新技术新方法研究室是研究所的核心分析性实验室,各种新型仪器装置在这两个研究室的核

20、心位置非常突出。为突出学科特点,针对学校的设备现状和必要性,重点购置生物物理新技术设备,比如我所就制定了重点购置核磁共振成像仪、扫描探针显微镜、X射线晶体衍射仪、激光光镊、差示量热扫描仪、膜片钳、流式细胞计数仪、人工拉膜机的计划,这些设备必将成为整个研究所的核心装备。最后,理论生物物理研究室将负责整个研究所甚至校内的相关实验数据的后期处理、统计分析和模型建立,购买必要的数据库和一定的存储、运算装置(高速计算机)与软件(生物信息学、计算生物学、理论物理学)是十分必要的。总体上,研究所仪器的购买除了要注重研203究所的学科特点外,也应考虑到这些仪器设备的校内共享可能性。研究所在创新人才培养中的作用校内研究所承担着课题研究和科研人才培养的双重任务,这是科学发展过程中互相促进的两个层面。科研人才培养的意义在于科学研究的创新力,在于科学知识的传承和科研精神的光大,研究所应该成为"教、学、研"的重要平台。本科创新人才培养高校研究所的科研人员往往属于教学科研型教师系列,在从事科学研究的同时,还必须承担一定课时量的本科教学工作。在国家大力倡导创新教育的背景下,如何把