HPLC法测定艾司唑仑血药浓度的方法验证

1、HPLC 法测定艾司唑仑血药浓度的方法验证侯大平，张志国#，国玉芝，雷力力，黄展（佳木斯大学附属第一医院，佳木斯市154002）中图分类号R 969. 1；R 971+. 3文献标识码A文章编号1001-0408（2011）14-1280-03摘要目的：建立测定艾司唑仑血药浓度的方法，以确定较好的检测条件。方法：采用高效液相色谱法，以依利特Hypersil1ODS 2C 18为色谱柱，甲醇-乙腈-水（282854）为流动相，1. 0mL ·min 为流速，35为柱温，230nm 为检测波长，地西泮为内标，考察服用艾司唑仑片患者血浆、碱化血浆、血清浓度并对选定的标本及提取方法进行验证。

2、结果：艾司唑仑血浆浓度明显高于碱化血浆及血清浓度，经成对双侧t 检验，艾司唑仑血浆浓度与碱化血浆及血清浓度比较（P 分别为0. 01130、0. 01817），有显著性差异。艾司唑仑血药浓度在0. 04941. 2896g ·mL 1范围内线性关系良好（r 0. 9918），定量下限为0. 0494g ·mL 1；平均日内、日间RSD 均10，平均回收率为99. 95100. 79。结论：采用患者血浆作为标本进行艾司唑仑血药浓度监测和药物中毒的定量分析可行，本方法简便、准确。关键词艾司唑仑；血浆；碱化血浆；血清；高效液相色谱法；血药浓度Method Validation o

3、f Plasma Concentration Determination of Estazolam by HPLC HOU Da-ping ，ZHANG Zhi-guo ，GUO Yu-zhi ，LEI Li-li ，HUANG Zhan （The First Affiliated Hospital of Jiamusi University ，Jiamusi 154002，China ）ABSTRACT OBJECTIVE ：To establish the method for plasma concentration determination of estazolam ，and to

4、confirm optimal determination conditions. METHODS ：HPLC method was adopted. The determination was performed on Elite Hypersil ODS 2C 18column with methanol-acetonitrile-water （282854）as mobile phase at flow rate of 1. 0mL ·min 1. The column temperature was set at 35and detection wavelength was

5、230nm. Diazepam was used as the internal standard. The concentrations of estazolam in plasma ，alkalinized plasma and serum in patients receiving estazolam were determined. Selected samples and extraction method were verified. RESULTS ：Plasma concentration of estazolam was significantly higher than t

6、hose in alkalinized plasma and serum. In bilateral paired t test ，the concentration of estazolam in plasma was significantly different from that in alkalinized plasma and serum （P 0. 01130and P 0. 01817）. The linear range of estazolam was 0. 04941. 2896g ·mL 1（r 0. 9918）. The minimum quanti-tat

7、ion limit was 0. 0494g ·mL 1. The average recovery rate was 99. 95100. 79. The RSD of intra-day and inter-day were less than 10. CONCLUSION ：It is feasible to collect plasma sample of patients for plasma concentration monitoring of estazolam and quantitation analysis of drug poisoning. The meth

8、od is simple ，accurate. KEY WORDS Estazolam ；Plasma ；Alkalinized plasma ；Serum ；HPLC ；Plasma concentration 艾司唑仑为临床常用的镇静催眠药，也可用于抗焦虑、抗癫痫治疗，大剂量可引起外周神经肌肉阻滞、兴奋不安等不良反应，严重的可导致死亡。鉴于其临床应用广泛，监测其血药浓度对临床治疗和中毒抢救均有重要意义。然而，在高效液相色谱（HPLC ）法测定艾司唑仑血药浓度时，文献报道有使用123血浆、碱化血浆和血清作为标本检测，为确定一种较好的方法，本文对使用标本、提取方法进行了初选，结果使用血浆作为标

9、本，艾司唑仑检出率较高。以此为基础，对HPLC 法检测血浆艾司唑仑血浆药物浓度方法进行了验证，结果证明此法简便、准确。艾司唑仑标准品（中国药品生物制品检定所，批号：1219-0102）；内标：地西泮标准品（中国药品生物制品检定所，批号：171225-200302）；甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。22. 1方法与结果11. 1材料仪器P 230高效液相色谱仪（大连伊利特分析仪器有限公司）；XW-80涡旋混合器（上海精科实业有限公司）；AUW 220D 十万分之一分析天平（日本岛津公司）。1. 2试药科杂志，1994，9（6）：343.色谱条件色谱柱：Hypersil ODS 2C 18

10、（250mm×4. 6mm ，5µm）；流动1相：甲醇-乙腈-水（282844）；流速：1. 0mL ·min ；检测波长：230nm ；柱温：35；进样量：20µL。2. 2标准溶液的制备2. 2. 1艾司唑仑标准溶液：准确称取艾司唑仑标准品24. 80mg ，置于100mL 容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取该溶液5mL ，置于50mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得浓度为0. 0248mg ·mL 1的艾司唑仑标准溶液。2. 2. 2内标溶液：准确称取地西泮标准品5. 00mg ，置于25mL 容量瓶中，用甲醇溶解并稀释

11、至刻度，摇匀。精密量取该溶液5高瑞林，李华，杨辉，等. 静脉注射a 12b 干扰素治疗婴幼儿病毒性肺炎疗效分析J.中国综合临床，2001，17（7）：560.主任药师。研究方向：临床药学。电话通讯作者：主任药师。研究方向：药物分析与药动学。电话：China Pharmacy 2011V ol. 22No. 140454-8623372。E-mail ：zzg-0000 ·1280·中国药房201122卷第14期（收稿日期：2010-10-27年第修回日期：2010-11-27）5mL ，置于50mL 容量瓶中，加甲醇至刻度摇匀，即得浓度为0. 0

12、2mg ·mL 1的地西泮溶液，作为内标溶液。2. 3使用标本及提取方法初选2. 3. 1血样的采集：随机选取我院门诊服用艾司唑仑患者10名，男、女各半，年龄2855岁。晚1000时口服艾司唑仑片2mg ，200mL 温开水送服。于服药后次日晨900时用柠檬酸钠抗凝和无抗凝剂真空管采集外周静脉血，分离出血浆或血清后，置10以下冰箱保存待用。2. 3. 2血样处理：（1）精密取患者血浆1mL ，置于10mL 玻璃试管内，加入0. 02mg ·mL 1地西泮内标溶液25µL，涡旋混匀，加入乙酸乙酯5mL ，涡旋震荡3min ，3500r ·min 1离心10

13、min ，分离乙酸乙酯于10mL 试管内，45下N 2气流吹干，甲醇100µL溶解，作为血浆样品溶液。（2）精密取患者血浆1mL ，置1于10mL 玻璃试管内，加入0. 02mg ·mL 地西泮内标溶液25µL，加入0. 01mol ·L 1氢氧化钠0. 25mL 碱化，涡旋混匀，加入乙酸乙酯5mL ，涡旋震荡3min ，3500r ·min 1离心10min ，分离乙酸乙酯于10mL 试管内，45下N 2气流吹干，甲醇100µL溶解，作为碱化血浆样品溶液。（3）精密取患者血清1mL ，置于110mL 玻璃试管内，加入0. 02mg

14、·mL 地西泮内标溶液25µL，涡旋混匀，加入乙酸乙酯5mL ，旋涡震荡3min ，3500r ·min 1离心10min ，分离乙酸乙酯于10mL 试管内，45下N 2气流吹干，甲醇溶解100µL，作为血清样品溶液。2. 3. 3血样测定：分别取血浆样品、碱化血浆样品和血清样品，按“2. 1”项色谱条件进样检测，以内标法计算含量，结果如表1。表13组样品含量测定结果Tab 1Content determination of samples of 3groups序号12345678910血浆0. 084130. 069270. 108310. 07389

15、0. 049650. 079060. 090820. 071190. 057220. 173950. 08575艾司唑仑含量/g·mL -1碱化血浆0. 079120. 054420. 083290. 028100. 055280. 070650. 062970. 056490. 046120. 171820. 07113血清0. 081800. 053190. 080270. 029240. 058520. 075340. 063100. 055460. 047860. 169820. 07146mV 321600321mV 32160691215min 03691215minA

16、B图1高效液相色谱图A. 血浆样品+内标；B. 空白血浆；1. 艾司唑仑；2. 地西泮Fig 1HPLC ChromatogramsA. plasma+internalstandard ；B. blank plasma ；1. estazolam ；2. diazepam2. 5标准曲线的制备精密取健康人血浆1mL ，置于10mL 玻璃试管内，加入0. 02mg ·mL 1地西泮内标溶液25µL，加入0. 0248mg ·mL 1艾司唑仑标准液分别为2、6、10、14、18、22、26、52µL，涡旋混匀，加乙酸乙酯5mL ，涡旋震荡3min ，3500

17、r ·min 1离心10min ，分离乙酸乙酯于10mL 试管内，45下N 2气流吹干，甲醇100µL溶解，按“2. 1”项色谱条件进样，记录色谱。将艾司唑仑的标准浓度（X ）对其峰面积与内标峰面积比值（Y ）进行线性回归，得艾司唑仑回归方程为Y 1. 3183X +0. 0656（r 0. 9918），结果表明，艾司唑仑血药浓度在0. 04941. 2896g ·mL 1范围内线性关系良好，定量下限为0. 0494g ·mL 1。2. 6加样回收率及精密度试验按“2. 4”项下方法，分别配制含艾司唑仑0. 3968、0. 2480、10. 0992g

18、·mL 高、中、低3种浓度的样品各5份，按“2. 1”项色谱条件进样检测，以内标法计算回收率；同法制备含艾司唑仑高、中、低3种浓度样品各1份，分别在同日不同时间进样5次，以及在3d 内进样5次，以样品及内标峰面积比值计算日内及日间精密度。精密度及回收率试验结果见表2。表2精密度及回收率试验结果（n 5）Tab 2Results of recovery and precision tests （n 5）加入量/g·mL -10. 39680. 24800. 0992测得量/g·mL -10. 3999±0. 03040. 2482±0. 0725

19、0. 9915±0. 0964回收率/100. 79100. 1099. 95RSD 日内RSD 日间RSD /3. 015. 584. 467. 243. 244. 129. 655. 818. 542. 7将3组样品分别进行成对双侧t 检验：血浆、碱化血浆样品检测含量比较，P 0. 01130，有显著性差异；血浆、血清样品检测含量比较，P 0. 01817，有显著性差异；碱化血浆样品、血清样品检测含量比较，P 0. 74081，无显著性差异。可见血浆样品艾司唑仑含量约是碱化血浆和血清样品的1. 2倍。因而选定以血浆样品作为艾司唑仑血药浓度检测的标本。2. 4色谱行为精密取健康人血

20、浆1mL ，置于10mL 玻璃试管内，加入0. 0248mg ·mL 1的艾司唑仑标准溶液10µL，0. 02mg ·mL 1地西泮内标溶液25µL，涡旋混匀，加入乙酸乙酯5mL ，涡旋振荡3min ，3500r ·min 1离心10min ，分离乙酸乙酯于10mL 试管内，45下N 2气流吹干，甲醇100µL溶解；同法制备不含艾司唑仑和内标的空白血浆溶液。按“2. 1”项色谱条件进样，高效中国药房2011年第22卷第14期液相色谱图见图1。血浆样品室温放置稳定性试验用空白血浆制备含艾司唑仑0. 3968、0. 2480、0. 099

21、2g ·mL 1高、中、低3种浓度的样品，室温放置，分别于0、24、48h 时取样，按“2. 4”项方法处理并测定。结果艾司唑仑含量RSD 分别为5. 84、10. 54和9. 12，表明样品在室温放置稳定。3讨论艾司唑仑口服吸收后，血浆蛋白结合率为934，2010年版中国药典中艾司唑仑性状项下表述为“本品在三氯甲烷中易溶，；在醋酐中易溶”，这可能是血浆浓度高于碱化血浆和血清浓度的主要原因；同时提取溶媒的不同也可能是造2，3成与其他作者产生试验差异的原因。在进行使用标本及提取方法初选时使用服药患者血样是考虑到药物吸收后会与血浆蛋白结合，而体外加入药品会影响与血浆蛋白结合，因而选用了患

22、者血样作为试验标本。1本试验曾选用甲醇-水（6535）、甲醇-乙腈-水（3030240）作为流动相，最终发现采用甲醇-乙腈-水（282844）的比例，2组分分离度较好；曾考虑采用卡马西平为内标，但在此试China Pharmacy 2011V ol. 22No. 14。由于地西泮验条件下，卡马西平与艾司唑仑不能有效分离·1281·LC-MS/MS法测定人血浆中硫酸氨基葡萄糖浓度及其药动学研究#栗艳，田云，关月，奚苗苗，常瑛，文爱东（第四军医大学西京医院药剂科，西安市710032）中图分类号R 969. 1文献标识码A 文章编号1001-0408（2011）14-1282-0

23、4摘要目的：建立测定人血浆中硫酸氨基葡萄糖浓度的方法，并考察其药动学特征。方法：采用高效液相色谱串联质谱电喷雾检测（LC-MS/MS）法，色谱柱为Phenomenex ODS ，流动相为甲醇-0. 2醋酸铵-0. 1甲酸缓冲液（梯度洗脱），流速为1. 0mL ·min 1；电喷雾电离源，正离子模式下以选择反应监测（SRM ）方式进行监测。以DAS 2. 0软件进行房室模型拟合，计算主要药动学参数。结果：在选定的色谱及质谱条件下，硫酸氨基葡萄糖与内标及血浆杂质分离良好，氨基葡萄糖增量浓度在8. 27165、1658268ng ·mL 1范围内线性关系良好。方法回收率为103.

24、 8113. 7，日内和日间RSD 均20。健康受试者单剂量口服低、中、高剂量（500、1000、1500mg ）复方硫酸氨基葡萄糖分散片后的药-时曲线符合非房室模型，主要药动学参数分别为：t 1/2为（1. 2±0. 4）、1（1. 3±0. 4）、（1. 4±0. 9）h ，t max （2. 6±1. 4）、（2. 7±0. 9）、（1. 9±0. 8）h ，c max （417±193）、（795±281）、（925±282）ng ·mL ，AUC 010（1416±1201）

25、、（3366±1020）、（4033±1282）ng ·h ·mL ，MRT 010（3. 2±0. 7）、（3. 6±0. 2）、（3. 3±0. 6）h ；多剂量口服低剂量（每次500mg ，ss 1sstid ）复方硫酸氨基葡萄糖分散片达到稳态后，主要药动学参数为：c max （294±75. 6）ng ·mL ，c min （59. 4±55. 7）ng ·mL 1，t max （1. 9±1. 1）h ，t 1/（）h ，AUC 010（1015±243）

26、ng ·h ·mL 1，AUC ss （1000±244）ng ·h ·mL 1，c ss av （125±30. 6）ng ·mL 1，MRT 010（2. 7±21. 4±0. 80. 3）。结论：本方法适用于复方硫酸氨基葡萄糖分散片人体内药动学研究。健康受试者单剂量口服本品后，氨基葡萄糖的吸收程度（AUC 0t 和c max ）与剂量在试验设计的剂量范围内存在一定的线性关系；连续口服本品后，在体内基本无积蓄现象。关键词复方硫酸氨基葡萄糖分散片；高效液相色谱串联质谱电喷雾检测法；药动学Determin

27、ation of Glucosamine Sulfate in Human Plasma by LC-MS/MSand Its Pharmacokinetic Study LI Yan ，TIAN Yun ，GUAN Yue ，XI Miao-miao ，CHANG Ying ，WEN Ai-dong （Dept. of Pharmacy ，Xijing Hospi-tal of Fourth Military Medical University ，Xi an 710032，China ）ABSTRACT OBJECTIVE ：To determine the concentration o

28、f glucosamine sulfate in human plasma ，and to study the pharmacoki-netics of glucosamine sulfate. METHODS ：The plasma concentration of glucosamine sulfate was determined by LC-MS/MS.The de-termination was performed on Phenomenex ODS column with mobile phase consisted of methanol-0. 2ammonium acetate

29、-0. 1formic acid buffer （gradient elution ）at flow rate of 1. 0mL ·min 1. Electrospray ionization （ESI ）was applied and operated in posi-tive ion mode by means of SRM. Its pharmacokinetic parameters were calculated by DAS 2. 0software. RESULTS ：Glucosamine sulfate was well-separated from intern

30、al standard and plasma impurity. The linear ranges of glucosamine were 8. 27165ng ·mL 1and 1658268ng ·mL 1with recoveries of 103. 8113. 7. The RSD of intra-day and inter-day were all lower than 20. The plasma concentration-time curves of glucosamine sulfate fitted with the non-compartment

31、model after single oral dose of Compound glucosamine sulfate dispersible tablets （500mg ，1000mg ，1500mg ）. The pharmacokinetic parameters were ：t 1/（）、（1. 3±21. 2±0. 40. 4）、（1. 4±0. 9）h ，t max （2. 6±1. 4）、（2. 7±0. 9）、（1. 9±0. 8）h ，c max （417±193）、（795±281）、（92

32、5±282）ng ·mL 1，AUC 010（1416±201）、（3366±1020）、（4033±1282）ng ·h ·mL 1，MRT 010（3. 2±0. 7）、（3. 6±0. 2）、（3. 3±0. 6）h ，respectively. The main pharmacokinetic parameters of multiple oral-dose of Compound glucosamine sulfate dispersible tablets were as follows ：c ss max （294±75. 6）ng ·mL 1，c ss min （59. 4±55. 7）ng ·mL 1，t max （1. 9±1. 1）h ，t 1/（）h ，AUC 010（1015±243）ng ·h ·