第六章质粒(参考)

1、第六章第六章 质质 粒粒 (plasmid) 质粒：质粒：是指存在于细菌、真菌等微生物细胞中、独立于染是指存在于细菌、真菌等微生物细胞中、独立于染 色体外、能进行自我复制的遗传因子。色体外、能进行自我复制的遗传因子。 a、可以整合到染色体上，又可以游离于染色体外（附加体）、可以整合到染色体上，又可以游离于染色体外（附加体）b、质粒通常是共价、闭合、环状双链、质粒通常是共价、闭合、环状双链DNA(covalent closed circular DNA，简称，简称cccDNA)，c、分子大小范围从、分子大小范围从l kb左右到左右到1000 kb。自自20世纪世纪80年代中期以来，年代中期以来，

2、在链霉菌、酵母、丝状真菌等微在链霉菌、酵母、丝状真菌等微生物中都发现了线状生物中都发现了线状DNA质粒，甚至还有质粒，甚至还有RNA质粒。质粒。质粒对宿主细胞是非必需的，但在某些条件下，质粒能赋予质粒对宿主细胞是非必需的，但在某些条件下，质粒能赋予宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长的优势。宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长的优势。如抗药性质粒和降解性质粒就能使宿主细胞在有相应药物或如抗药性质粒和降解性质粒就能使宿主细胞在有相应药物或化学毒物的环境中生存。化学毒物的环境中生存。质粒也像染色体一样携带编码多种遗传性状的基因，并授予质粒也像染色体一样携带编码多种遗传性状的基因，并授予宿主

3、细胞一定的遗传特性，许多与医学、农业、工业和环境宿主细胞一定的遗传特性，许多与医学、农业、工业和环境密切相关的重要细菌的特殊特征便是由质粒编码的，如植物密切相关的重要细菌的特殊特征便是由质粒编码的，如植物结瘤、固氮、对有机物的代谢等。结瘤、固氮、对有机物的代谢等。 在基因工程和分子生物学的发展过程中，质粒也起着非常重在基因工程和分子生物学的发展过程中，质粒也起着非常重要的作用。以质粒为载体进行的基因克隆技术，在原核生物要的作用。以质粒为载体进行的基因克隆技术，在原核生物和真核生物中表达外源蛋白的方法和技术已在工、农、医各和真核生物中表达外源蛋白的方法和技术已在工、农、医各个领域中得到广泛应用。

4、个领域中得到广泛应用。因此，对质粒的研究无论在理论上或应用上均具有十分重要因此，对质粒的研究无论在理论上或应用上均具有十分重要的意义，是现代生物学研究中的重要课题之一。的意义，是现代生物学研究中的重要课题之一。 第一节第一节 质粒的发现和命名质粒的发现和命名 大肠杆菌的大肠杆菌的F因子是第一个被发现因子是第一个被发现(1946年年)的细菌质粒，的细菌质粒，它的发现对细菌遗传学的发展产生了深远的影响。它的发现对细菌遗传学的发展产生了深远的影响。日本学者日本学者(1957年年)报道了志贺菌报道了志贺菌(Shigella)中质粒介导中质粒介导抗生素抗性的转移现象。在以后的抗生素抗性的转移现象。在以后

5、的20多年中，陆续发现各多年中，陆续发现各种细菌携带质粒，且它们的表型特征已远远超过了致育性种细菌携带质粒，且它们的表型特征已远远超过了致育性和药物抗性的范围。和药物抗性的范围。70年代末，随着遗传工程的崛起，质粒作为载体己被广年代末，随着遗传工程的崛起，质粒作为载体己被广泛应用在遗传工程和分子生物学的研究中。对很多不同微泛应用在遗传工程和分子生物学的研究中。对很多不同微生物中的质粒进行了基因克隆和生物学功能分析，使质粒生物中的质粒进行了基因克隆和生物学功能分析，使质粒的生物学跨入了空前繁荣的研究时期。的生物学跨入了空前繁荣的研究时期。 一、质粒的发现一、质粒的发现二、质粒的命名原则二、质粒的

6、命名原则 质粒可以依据其表型效应、大小、复制特性、转移性或亲和质粒可以依据其表型效应、大小、复制特性、转移性或亲和性差异划分为不同的类型。性差异划分为不同的类型。最初发现的质粒均由研究者根据表型、大小等特征自行命名，最初发现的质粒均由研究者根据表型、大小等特征自行命名，如如F因子因子(fertility factor，致育因子，致育因子)、R质粒质粒(resistance factor，抗性质粒，抗性质粒)和和Col质粒质粒(colicin，大肠杆菌毒素质粒，大肠杆菌毒素质粒)等。等。随着研究工作的深入和发展，愈来愈多的含有质粒的微生物随着研究工作的深入和发展，愈来愈多的含有质粒的微生物新类群

7、和新质粒被发现，由于缺乏统一的命名规则而导致文新类群和新质粒被发现，由于缺乏统一的命名规则而导致文献中质粒名称的混乱。直至献中质粒名称的混乱。直至1976年年Novick等才提出一个可等才提出一个可为质粒研究者普遍接受和遵循的命名原则。为质粒研究者普遍接受和遵循的命名原则。 其规则是：其规则是：u质粒的名称一般由三个英文字母及编号组成，第一个字质粒的名称一般由三个英文字母及编号组成，第一个字母一律用小写母一律用小写p表示，后两个字母应大写，可以采用发现表示，后两个字母应大写，可以采用发现者人名、实验室名称、表型性状或其他特征的英文缩写。者人名、实验室名称、表型性状或其他特征的英文缩写。u编号为

8、阿拉伯数字，用于区分属于同一类型的不同质粒，编号为阿拉伯数字，用于区分属于同一类型的不同质粒，如如pUC18和和pUC19等。等。第二节第二节 质粒的遗传特征质粒的遗传特征一、一、 质粒的大小和拷贝数质粒的大小和拷贝数 质粒的大小：以分子质量质粒的大小：以分子质量MDMD或碱基对数或碱基对数kbkb表示，表示，1MD1MD的双链的双链DNA=1.65kbDNA=1.65kb。质粒的大小质粒的大小一般在一般在1-200kb，最大的可达，最大的可达1400kb(如苜蓿根瘤如苜蓿根瘤菌菌质粒质粒pRm141a)。质粒的拷贝数是指同一质粒在每个细胞中的数量，不同的质粒的拷贝数是指同一质粒在每个细胞中的

9、数量，不同的质粒在同一细胞中的拷贝数有差异。质粒在同一细胞中的拷贝数有差异。质粒拷贝数是确定某种质粒特性的一个重要参数，从中也质粒拷贝数是确定某种质粒特性的一个重要参数，从中也可获得其复制本质的基本信息。一般而言，质粒的拷贝数可获得其复制本质的基本信息。一般而言，质粒的拷贝数与其分子质量成反比关系，分子质量大的拷贝数低，分子与其分子质量成反比关系，分子质量大的拷贝数低，分子质量小的拷贝数高。质量小的拷贝数高。 质粒可根据其拷贝数分为质粒可根据其拷贝数分为严谨型质粒（严谨型质粒（Stringent plasmid）和和松弛型质粒（松弛型质粒（Relaxed plasmid）。n 质粒在细胞内复制

10、时受到控制而与染色体复制同步进行，被质粒在细胞内复制时受到控制而与染色体复制同步进行，被称为严称为严谨谨型质粒。其拷贝数也低，通常只有型质粒。其拷贝数也低，通常只有1-3个拷贝。个拷贝。 如如F质粒，每个细胞中只有质粒，每个细胞中只有1-2个拷贝，它们的复制受到严格个拷贝，它们的复制受到严格控制，属于严控制，属于严谨谨型质粒或低拷贝质粒。型质粒或低拷贝质粒。n 另一类质粒的复制与染另一类质粒的复制与染色体复制不同步，称为松驰型质粒。色体复制不同步，称为松驰型质粒。通常每个细胞含有通常每个细胞含有10-100个拷贝，属于高拷贝质粒。个拷贝，属于高拷贝质粒。 分子量小的分子量小的CoLEl质粒，每

11、个细胞中有质粒，每个细胞中有10-100个拷贝，个拷贝，它们的复制不受到严格控制，称为松弛型质粒或高拷贝质粒。它们的复制不受到严格控制，称为松弛型质粒或高拷贝质粒。 含有松弛型质粒的菌株在含有氯霉素的培养液中细胞分裂含有松弛型质粒的菌株在含有氯霉素的培养液中细胞分裂受到抑制，染色体受到抑制，染色体DNA也停止了复制，但所含的也停止了复制，但所含的ColEl质粒质粒可持续复制可持续复制1015小时，直到每一个细胞中含有小时，直到每一个细胞中含有1 0003 000个质粒。基因工程研究中所用的载体质粒大多数是这一个质粒。基因工程研究中所用的载体质粒大多数是这一类型的质粒。类型的质粒。n 控制拷贝数

12、的基因存在质粒上，同时也是宿主和质粒相控制拷贝数的基因存在质粒上，同时也是宿主和质粒相互作用的结果。互作用的结果。 类型类型代表质粒代表质粒大小（大小（kb）拷贝数拷贝数宿主宿主表型特征表型特征致育因子F因子95-1001-3大肠杆菌, 沙门氏菌, 柠檬酸杆菌性纤毛、接合转移R质粒RP4541-3假单胞菌和其它G阴性菌性纤毛、接合转移，抗Ap、Km、Nm、Tc R1801-3G阴性菌抗Ap、Km、Su、Cm、Sm R6981-3大肠杆菌, 奇异变形杆菌抗Km、Nm、Su、Cm、Sm R100901-3大肠杆菌, 志贺杆菌, 沙门氏菌Cm, Sm, Su, Tc, Hg pSH621 金黄色葡萄

13、球菌Gm, Tm, Km pAD225 粪肠球菌Em, Sm, KmCol质粒ColE1910-30大肠杆菌产大肠杆菌素E1 ColE2 10-15志贺杆菌产大肠杆菌素E2 ColDF13 阴沟杆菌产大肠杆菌素DF13毒性质粒Ent（P307）83 大肠杆菌产肠毒素 K88质粒 大肠杆菌粘附抗原 ColV-K302 大肠杆菌摄铁载体, 免疫机制抗性 pZA1056 金黄色葡萄球菌肠毒素B Ti200 根癌农杆菌诱导肿瘤代谢质粒CAM230 假单胞菌樟脑降解 SAL56 假单胞菌水杨酰降解 TOL75 恶臭假单胞菌甲苯降解 pJP4 假单胞菌2,4-二氯苯乙酰降解 pSym 根瘤菌共生固氮质粒大

14、小和类型质粒大小和类型 二、二、 质粒的复制质粒的复制 复制子复制子(replicon)是一个复制单位，细菌染色体是一个复是一个复制单位，细菌染色体是一个复制子，每一个质粒也是一个复制子。制子，每一个质粒也是一个复制子。 复制起点是复制子起始复制的部位，作为一个复制子，复制起点是复制子起始复制的部位，作为一个复制子，至少需要有一个复制起点，即至少需要有一个复制起点，即ori位点。大肠杆菌染色体的位点。大肠杆菌染色体的复制起点称为复制起点称为oriC，质粒的复制起点叫做，质粒的复制起点叫做oriV。 质质 粒粒 复复 制制 子子 拷拷 贝贝 数数pBR322及其衍生质粒及其衍生质粒 pMB1 1

15、5-20pUC系列质粒系列质粒 pMB1 500-700pACYC及其衍生质粒及其衍生质粒 p15A 10-12pSC101及其衍生质粒及其衍生质粒 pSC101 5 ColE1 ColE1 15-20几种常见质粒载体所携带的复制子几种常见质粒载体所携带的复制子 质粒的复制主要是通过质粒的复制主要是通过型复型复制和滚环复制两种方式之一进制和滚环复制两种方式之一进行的，其中以行的，其中以型复制为主。型复制为主。在在型复制中，有单向复制和型复制中，有单向复制和双向复制两种类型。双向复制两种类型。革兰氏阴性细菌中多数质粒是革兰氏阴性细菌中多数质粒是以以型方式复制，型方式复制，R1、R100等等是单向

16、复制，是单向复制，F、R6k等是双等是双向复制类型。向复制类型。1. 质粒复制的方式质粒复制的方式 质粒滚环复制示意图质粒滚环复制示意图 质粒只编码一种或质粒只编码一种或少数几种与复制有少数几种与复制有关的蛋白质，而复关的蛋白质，而复制所需要的其他蛋制所需要的其他蛋白，如白，如DNADNA聚合酶、聚合酶、引物酶、连接酶、引物酶、连接酶、RNA-HRNA-H酶、旋转酶酶、旋转酶(gyrase)(gyrase)和拓扑异和拓扑异构酶构酶I I、DnaBDnaB和和DnaCDnaC等都是利用寄等都是利用寄主的复制酶体系。主的复制酶体系。在革兰氏阳性细菌中大多在革兰氏阳性细菌中大多数质粒是以滚环方式复制

17、。数质粒是以滚环方式复制。v 复制起点是一段特定的复制起点是一段特定的DNA序列，长约几百碱基对，在序列，长约几百碱基对，在其相关的调控元件中含有由质粒或宿主染色体编码的、参与其相关的调控元件中含有由质粒或宿主染色体编码的、参与DNA合成起始调控因子的结合位点。合成起始调控因子的结合位点。v 在大多数质粒中，与复制有关的蛋白质基因位于它们的作在大多数质粒中，与复制有关的蛋白质基因位于它们的作用位点用位点ori序列附近，因此序列附近，因此ori位点周围的小范围位点周围的小范围DNA是质是质粒复制所必需的。粒复制所必需的。v 如果质粒如果质粒DNA的大部分区域被去掉，而只保留质粒的的大部分区域被去

18、掉，而只保留质粒的ori序列，而且质粒是环状的，则质粒仍然能进行复制。序列，而且质粒是环状的，则质粒仍然能进行复制。 2. 复制起点复制起点(ori)区的功能区的功能 v 将将ori区克隆到一个不能自主复制的环状双链区克隆到一个不能自主复制的环状双链DNA分子分子上并引入到原核细胞后，该重组上并引入到原核细胞后，该重组DNA具有自主复制能力。具有自主复制能力。分子克隆中常用的质粒载体就是以这种方法构建的，同时用分子克隆中常用的质粒载体就是以这种方法构建的，同时用这种方法可以确定哪部分这种方法可以确定哪部分DNA是是ori区并研究区并研究ori区的功能。区的功能。vori区域常决定了质粒的许多特

19、性，如质粒的寄主范围和区域常决定了质粒的许多特性，如质粒的寄主范围和质粒的拷贝数。质粒的拷贝数。质粒的寄主是指质粒能在其中自我复制的生物种类。质粒质粒的寄主是指质粒能在其中自我复制的生物种类。质粒的寄主范围通常是由的寄主范围通常是由ori区决定的。有些质粒如区决定的。有些质粒如ColEl类型的类型的质粒，包括质粒，包括pBR322、pET和和pUC具有较窄的寄主范围，这具有较窄的寄主范围，这些质粒只在些质粒只在E.coli及一些亲缘关系较近的如沙门菌和克氏杆及一些亲缘关系较近的如沙门菌和克氏杆菌菌(Klebsiella)中复制。中复制。相反，相反，RP4、RK2和和RSFl010及从及从G+细

20、菌中分离的滚环复制细菌中分离的滚环复制的质粒都属于广寄主范围的质粒都属于广寄主范围(broad host range)质粒。广寄主范质粒。广寄主范围的质粒一般能编码与复制起始有关的所有蛋白，这样就不围的质粒一般能编码与复制起始有关的所有蛋白，这样就不依赖于寄主的功能。依赖于寄主的功能。三、三、质粒复制的调控质粒复制的调控 质粒的复制机理与细菌染色体的基本相同，质粒的复制机理与细菌染色体的基本相同，但二者之间的复制调控则有区别。至今所研究的但二者之间的复制调控则有区别。至今所研究的质粒，其复制调控一般采用直接或间接的负调控质粒，其复制调控一般采用直接或间接的负调控机制，负调控因子可以是蛋白质、机

21、制，负调控因子可以是蛋白质、RNA或或DNA重重复序列。复序列。目前关于质粒的调控大致可以分为两种类型：目前关于质粒的调控大致可以分为两种类型： 抑制物抑制物-靶位调控（靶位调控（inhibitor-target regulation） 重复子重复子-竞争结合调控（竞争结合调控（iteron-binding regulation）1. 抑制物抑制物-靶位调控靶位调控u特点是依赖一小段反向转录的特点是依赖一小段反向转录的RNA作为抑制物，通作为抑制物，通过与目标过与目标RNA的互补结合阻止质粒复制的起始。的互补结合阻止质粒复制的起始。u目标目标RNA是质粒是质粒DNA复制的引物或用于编码复制所复

22、制的引物或用于编码复制所需的需的Rep蛋白的蛋白的mRNA。u属于这一类复制调控的质粒有属于这一类复制调控的质粒有ColE1、pT181、p15A、pMB1、RSF1010、CloDF13、R1等。等。1）ColE1质粒的复制调控质粒的复制调控 ColE1为为6.6kb的小质粒，拷贝数的小质粒，拷贝数1020。其复制。其复制不需任何质粒编码的蛋白质，而是完全依赖于宿主提不需任何质粒编码的蛋白质，而是完全依赖于宿主提供的寿命较长的酶和蛋白质，包括分子伴侣、供的寿命较长的酶和蛋白质，包括分子伴侣、DNA聚聚合酶合酶I和和, DNA依赖的依赖的RNA聚合酶、核糖核酸酶聚合酶、核糖核酸酶H (RNas

23、e H), DNA促旋酶和拓扑异构酶促旋酶和拓扑异构酶I。 ColE1质粒质粒DNA的复制，从的复制，从oriV开始，单向进行。控开始，单向进行。控制此种质粒制此种质粒DNA复制启动的两种关键因素复制启动的两种关键因素RNAI和和RNA，以及另一种负调控因子，以及另一种负调控因子Rop蛋白，都是由蛋白，都是由ColE1 DNA转录产生的。转录产生的。uRNA也叫做复制引物。也叫做复制引物。RNA分子在转录起点附近同互补分子在转录起点附近同互补的模板的模板DNA形成一种杂交分子，被形成一种杂交分子，被RNaseH酶所切割，从而释酶所切割，从而释放出放出3-OH末端，作为供末端，作为供DNA聚合酶

24、聚合酶合成合成DNA的引物。的引物。 RNA前体的合成起始于其复制起点上游前体的合成起始于其复制起点上游555bp处的启动处的启动子区，继而穿过复制起点，终止于下游大约子区，继而穿过复制起点，终止于下游大约150个核苷酸附近个核苷酸附近的一个位点。此约的一个位点。此约750个核苷酸的起始转录物的个核苷酸的起始转录物的5端折叠成复端折叠成复杂的二级结构，从而使杂的二级结构，从而使RNA产生一个富产生一个富G环，后者与位于模板环，后者与位于模板链复制起点上游链复制起点上游20个核苷酸处的质粒个核苷酸处的质粒DNA富富C区正好匹配。随区正好匹配。随后，该后，该RNA转录产物由转录产物由RNaseH加

25、工为成熟引物，其切割位点加工为成熟引物，其切割位点位于复制起点内位于复制起点内5个个A序列中。所得的序列中。所得的555个核苷酸的成熟个核苷酸的成熟RNA II被被DNA聚合酶聚合酶I用作引物启动前导链的合成。用作引物启动前导链的合成。-555bpRNA II(primase)oriRNaseH质粒质粒DNA的复制过程的复制过程 uRNA是复制的负调节物是复制的负调节物 RNA可以通过同可以通过同RNA结合，结合，以阻止其与模板以阻止其与模板DNA发生杂交作用。发生杂交作用。colE1复制子不能影响质粒复制所必需的宿主酶的活性，复制子不能影响质粒复制所必需的宿主酶的活性，因此，一旦因此，一旦D

26、NA合成启动后，便不能改变其速度或进程。合成启动后，便不能改变其速度或进程。故而拷贝数的控制必须在故而拷贝数的控制必须在DNA复制启动时或启动前进行。复制启动时或启动前进行。质粒质粒DNA的合成依赖于复制起点处稳定的的合成依赖于复制起点处稳定的DNA-RNA II杂交体的形成。正常情况下，复制的起始是由正确折叠与杂交体的形成。正常情况下，复制的起始是由正确折叠与不当折叠的不当折叠的RNA II间相互转化的平衡来控制的，前者可形间相互转化的平衡来控制的，前者可形成稳定的杂交体，后者则不能。成稳定的杂交体，后者则不能。这一平衡的改变主要由这一平衡的改变主要由RNA来控制，来控制，RNA是由是由RN

27、A基因的反义链编码的基因的反义链编码的108个碱基小分子转录物。它个碱基小分子转录物。它折叠成可与新生折叠成可与新生RNA II前体结合的三叶草结构，从而阻止前体结合的三叶草结构，从而阻止后者折叠成形成稳定杂交体所必需的二级结构后者折叠成形成稳定杂交体所必需的二级结构。ColE1质粒复制起点结构质粒复制起点结构与与RNA I的配对有的配对有可能引起可能引起引物引物RNA二级结构二级结构的改变，的改变，从而阻止从而阻止了了3-OH 的 产 生的 产 生（ RNaseH 不 能 切不 能 切割 ） 。割 ） 。uROM/ROP蛋白对蛋白对RNA负调节活性的调控负调节活性的调控由质粒编码的一种被称为

28、由质粒编码的一种被称为ROM(RNA modulator)或或ROP(repressor of primer)的蛋白质可提高的蛋白质可提高RNA与与RNA结合的效率。结合的效率。ROM蛋白通过促进蛋白通过促进RNA和和RNA杂杂交体的形成，增强交体的形成，增强RNA的负调节作用。的负调节作用。ROM是含有是含有63个氨基酸的多肽的同型二聚体，它由位于个氨基酸的多肽的同型二聚体，它由位于colE1复制起点下游复制起点下游400个核苷酸处的一个基因所编码。该个核苷酸处的一个基因所编码。该二聚体每个亚单位含有由一个转角连接的两个二聚体每个亚单位含有由一个转角连接的两个螺旋，因而螺旋，因而此二聚体是由

29、此二聚体是由4个个螺旋组成的呈双重对称的紧密束状结构。螺旋组成的呈双重对称的紧密束状结构。ROM蛋白与蛋白与RNA和和RNA具有相似的亲和力。它促使具有相似的亲和力。它促使这两种这两种RNA分子的互补结合物由不稳定的中间体变为更稳定分子的互补结合物由不稳定的中间体变为更稳定的结构。的结构。rom/rop基因缺失至少可使基因缺失至少可使colE1质粒拷贝数提高两个数量级。例质粒拷贝数提高两个数量级。例 如，如，rom /rop基因的缺失可使较早期组建的载体基因的缺失可使较早期组建的载体pBR322在每个细菌细胞中的在每个细菌细胞中的质粒拷贝数从质粒拷贝数从1520个增至个增至500个以上，在个以

30、上，在rom/rop基因中插入一段外源基因中插入一段外源DNA片段，则可导致致死性的大量质粒片段，则可导致致死性的大量质粒DNA复制。复制。2）R1质粒的复制调控质粒的复制调控uR1质粒是质粒是IncF类型的代表质粒，其复制调控也是在类型的代表质粒，其复制调控也是在RNA和蛋白质的作用下进行的，但和蛋白质的作用下进行的，但RNA是间接调控的。是间接调控的。u质粒复制起始所必需的质粒复制起始所必需的RepA蛋白能在两个启动子的作用蛋白能在两个启动子的作用下转录。质粒刚进入细胞尚无下转录。质粒刚进入细胞尚无CopB时，时，RepA在自身启动在自身启动子下迅速转录；当达到适当的拷贝数时，子下迅速转录

31、；当达到适当的拷贝数时，PrepA启动子被启动子被CopB阻遏，阻遏，RepA只能从只能从PcopB转录。转录。ucopA自身启动子带动下从自身启动子带动下从repA基因的互补链进行转录，基因的互补链进行转录，因此其因此其RNA与与repA的翻译起始区重叠但转录方向相反，二的翻译起始区重叠但转录方向相反，二者之间形成双链结构，被染色体编码的切割双链者之间形成双链结构，被染色体编码的切割双链RNA的的RNase降解。降解。BBBAAAPcopARNase2. 重复子重复子-竞争结合调控竞争结合调控nF、P1、R6k、RK2、RP4和和pSC101等质粒是通等质粒是通过过RepA进行复制调控的，它

32、们在复制起始位点（进行复制调控的，它们在复制起始位点（ori）和复制基因（和复制基因（rep）附近存在多个）附近存在多个17-22bp的的DNA短短片段，这些短片段被叫做重复子（片段，这些短片段被叫做重复子（iteron），含有重），含有重复子序列的质粒也叫重复子质粒（复子序列的质粒也叫重复子质粒（iteron plasmid）。）。n重复子能与复制必需的重复子能与复制必需的RepA蛋白竞争性结合，从而蛋白竞争性结合，从而抑制了质粒的复制和拷贝数的增加。抑制了质粒的复制和拷贝数的增加。转录自体调控（转录自体调控（transcriptional autoregulation）：）：RepA蛋白通

33、过与自身启动子区结合而抑制自身的合成蛋白通过与自身启动子区结合而抑制自身的合成p质粒浓度较低时，质粒浓度较低时，RepA只与一个质粒结合；质粒浓只与一个质粒结合；质粒浓度较高时，度较高时，RepA通过与重复子序列的结合使两个质粒通过与重复子序列的结合使两个质粒联结在一起，因此阻止了质粒的复制。联结在一起，因此阻止了质粒的复制。p重复子质粒的复制不仅受重复子质粒的复制不仅受RepA蛋白浓度的控制，而蛋白浓度的控制，而且受质粒浓度，更确切地说重复子序列浓度的控制。且受质粒浓度，更确切地说重复子序列浓度的控制。偶联模型（偶联模型（coupling or handcuffing model）：）：重复

34、重复子序列间的相互作用使两个质粒偶联在一起，从而抑制子序列间的相互作用使两个质粒偶联在一起，从而抑制了质粒复制的起始。了质粒复制的起始。四、四、不相容性和质粒的类群不相容性和质粒的类群质粒不相容性：质粒不相容性：是指亲缘关系相近的两种质粒，在非选择性条是指亲缘关系相近的两种质粒，在非选择性条件下常不能稳定地存在于同一个细胞中，经过若干代的培养，件下常不能稳定地存在于同一个细胞中，经过若干代的培养，只含有同一种质粒的细胞越来越多，而含有两种质粒的细胞相只含有同一种质粒的细胞越来越多，而含有两种质粒的细胞相对减少。这种现象称为质粒的不相容性（对减少。这种现象称为质粒的不相容性（incompatib

35、ility）。）。一般来说，同种质粒衍生物是不相容的，而不同质粒的一般来说，同种质粒衍生物是不相容的，而不同质粒的衍生物衍生物则可能是相容性的，也可能是不相容性的。则可能是相容性的，也可能是不相容性的。 n 质粒的不相容性也是与质粒复制起始的控制密切相关的。质粒的不相容性也是与质粒复制起始的控制密切相关的。由于性状相近的质粒通常具有相同或相似的复制调控机制，由于性状相近的质粒通常具有相同或相似的复制调控机制，其阻遏物其阻遏物(抑制物或重复序列抑制物或重复序列)亦相似，在调控时，它们也能亦相似，在调控时，它们也能随机地与其中的任一质粒的复制区结合而阻遏了其复制过程，随机地与其中的任一质粒的复制区

36、结合而阻遏了其复制过程，并进而使之在子代细胞中丢失。并进而使之在子代细胞中丢失。 由于阻遏物的结合是随机的，因此两个质粒在由于阻遏物的结合是随机的，因此两个质粒在子子代细胞中的代细胞中的出现几率相等，即各占出现几率相等，即各占50。对于高拷贝数质粒而言，质。对于高拷贝数质粒而言，质粒在子代细胞中的丢失需要多次分裂才能实现。粒在子代细胞中的丢失需要多次分裂才能实现。n 有些质粒能够稳定地存在于同一细胞中，是因为控制拷贝有些质粒能够稳定地存在于同一细胞中，是因为控制拷贝数的机制完全不同。数的机制完全不同。例如，例如，F质粒和质粒和ColE1质粒二者是相容的，也就是说，它们质粒二者是相容的，也就是说

37、，它们分别属于不同的不相容群（分别属于不同的不相容群（different incompatibility group）。）。有些细菌在同一个细胞中可以含有几种不同类型的质粒，例有些细菌在同一个细胞中可以含有几种不同类型的质粒，例如，如，Borrelia burgdorferi （博氏疏螺旋体博氏疏螺旋体 ）含有含有17种不种不同类型的环状和线状质粒。同类型的环状和线状质粒。n 在细菌中已区分出大量的不相容群（在细菌中已区分出大量的不相容群（Inc），同一种不），同一种不相容群的质粒享有调节它们复制子的共同机制。相容群的质粒享有调节它们复制子的共同机制。因此，也可以根据复制子是否相同来划分质粒的

38、不相容群，因此，也可以根据复制子是否相同来划分质粒的不相容群，携带有相同复制子的不同质粒属于同一不相容群，它们不携带有相同复制子的不同质粒属于同一不相容群，它们不能共存于同一细菌中。能共存于同一细菌中。带有不同复制子的质粒属于不同的不相容群，它们可以共带有不同复制子的质粒属于不同的不相容群，它们可以共存于同一细菌中。例如存于同一细菌中。例如p15A、R6K、F能与能与colE1质粒相质粒相容。容。 细菌种类细菌种类 质粒不相容群质粒不相容群 代表性质粒代表性质粒 革兰氏阴性细菌革兰氏阴性细菌IncFF, R386, R455, ColVF, R386, R455, ColV IncFR1, R

39、100R1, R100 IncFCol1B-K98Col1B-K98 IncFIncFR124R124 IncAIncARA1RA1 IncCIncCR40a, R55R40a, R55 IncHIncHR27, R726R27, R726 IncIIncIColIb-P9, R144, R483, R64, R621aColIb-P9, R144, R483, R64, R621a IncMIncMR69, R466bR69, R466b IncNIncNR46, R15, N3, pKM101R46, R15, N3, pKM101 IncOIncOR16, R723R16, R723 I

40、ncPIncPRP1, RP4, R68, R751, R690, RK2RP1, RP4, R68, R751, R690, RK2 IncQIncQRSF1010, pKT212, pKT230, pGSSRSF1010, pKT212, pKT230, pGSS IncWIncWR7K, R388, pSA747R7K, R388, pSA747 IncXIncXR6KR6K 革兰氏阳性细菌革兰氏阳性细菌pT181pT181pT181, pC221, pS194, pC223, pUB112, pE194pT181, pC221, pS194, pC223, pUB112, pE194

41、pUB110pUB110pBC110, pBC16pBC110, pBC16 pSN2pSN2pSN2, pE12, pIM13pSN2, pE12, pIM13五、质粒的稳定性五、质粒的稳定性 (细胞分裂中的质粒分配细胞分裂中的质粒分配)质粒的不稳定性（质粒的不稳定性（plasmid instability）包括两个方面：）包括两个方面： 分离的不稳定性（分离的不稳定性（segregation instability）：）：指在细胞分裂过程中，有一个细胞没有获得质粒指在细胞分裂过程中，有一个细胞没有获得质粒DNA，并最终增殖成为无质粒的优势群体，并最终增殖成为无质粒的优势群体结构的不稳定性（

42、结构的不稳定性（structural instability）：指）：指由于转座作用或重组作用引起的质粒由于转座作用或重组作用引起的质粒DNA的重排的重排或缺失。或缺失。1 1、每个世代每个质粒平均都必须至少发生一次复制；、每个世代每个质粒平均都必须至少发生一次复制；2 2、当细胞分裂时，复制产生的质粒拷贝必须平均分配、当细胞分裂时，复制产生的质粒拷贝必须平均分配 到两个子细胞中去。到两个子细胞中去。 要使质粒能够保持稳定的遗传，至少需要满足下要使质粒能够保持稳定的遗传，至少需要满足下面两个方面的条件：面两个方面的条件：在细胞分裂过程中，质粒分配到子细胞的途径可分为：在细胞分裂过程中，质粒分配

43、到子细胞的途径可分为： 随机分配随机分配(random distribution) 主动分配主动分配(active distribution) 这些质粒的稳定性是通过两种机制来实现的：这些质粒的稳定性是通过两种机制来实现的：（1 1）质粒编码的基因产物，如质粒编码的致死蛋白来抑）质粒编码的基因产物，如质粒编码的致死蛋白来抑制不含质粒的子细胞。制不含质粒的子细胞。（2 2）质粒上的分配体系（）质粒上的分配体系（par）。 1.主动分配的机理主动分配的机理 对低拷贝质粒而言，需要某种特定机制，将细胞分裂对低拷贝质粒而言，需要某种特定机制，将细胞分裂与质粒复制协调起来，以保证每个细胞至少获得一个拷与

44、质粒复制协调起来，以保证每个细胞至少获得一个拷贝。目前已对贝。目前已对F、R1分配机制进行了深入研究。分配机制进行了深入研究。par区叫做分配区区叫做分配区(partition region)或分配座位或分配座位(partition locus)：是指在细胞分裂过程中使质粒拷贝数均等的分配到是指在细胞分裂过程中使质粒拷贝数均等的分配到子子细胞中的质粒细胞中的质粒DNA序列。序列。在在F质粒中质粒中par区是同复制起点紧密相邻的，而在区是同复制起点紧密相邻的，而在R1质粒质粒中则是远离其复制起点。质粒的复制与分配是分开独立进中则是远离其复制起点。质粒的复制与分配是分开独立进行的，而且行的，而且p

45、ar区还会使无亲缘关系的其他质粒保持稳定。区还会使无亲缘关系的其他质粒保持稳定。 n主动分配体系的主动分配体系的par区区GGTCTGATTATTAGTCTGGGACCACGGTCCCACTCGTATCGTCCCAGACTAATAATCAGACCCTGGTGCCAGGGTGAGCATAGCAG-35-10SDsopAsopBsopCSopASopB在在F F质粒中，质粒中，parpar区由区由sopAsopA和和sopBsopB两个基因及两个基因及sopCsopC区组成区组成sopAsopA和和sopBsopB反反式作用基因式作用基因sopCsopC: :顺式作用位点，顺式作用位点，也叫类着丝

46、粒位点也叫类着丝粒位点12个个43bp的正向重复序列的正向重复序列SopB与与sopC区结合，形成蛋区结合，形成蛋白白-核酸复合物，该复合物参核酸复合物，该复合物参与质粒的分配。与质粒的分配。sopA和和sopB构成构成一个转录单位，一个转录单位，其产物其产物SopA和和SopB两种蛋白协两种蛋白协同抑制同抑制sopAB操操纵子的转录，属纵子的转录，属于自体阻遏蛋白。于自体阻遏蛋白。有一对有一对7bp的反向重复序列的反向重复序列 SopA蛋白与蛋白与sopAB转录单位的启动子区的操纵基因结合，转录单位的启动子区的操纵基因结合，对其转录进行调控；对其转录进行调控；SopB蛋白虽不能与蛋白虽不能与

47、sopAB操纵子的启动操纵子的启动子子结合，但它能结合，但它能促进促进SopA蛋白的结合能力。蛋白的结合能力。因此，因此，SopB蛋白必须维持在适当的浓度，才能保证蛋白必须维持在适当的浓度，才能保证F质质粒在细胞内的稳定性。粒在细胞内的稳定性。 复制复制质粒分配质粒分配细胞分裂细胞分裂质粒质粒分配复合体分配复合体复制体复制体一种尚未知的结构很快地将一种尚未知的结构很快地将两个质粒移向细胞的两极。两个质粒移向细胞的两极。细菌质粒细菌质粒DNA的分配模型图的分配模型图质粒质粒DNA在位于细胞中央在位于细胞中央的复制体的复制体(replisome)的的作用下进行复制。质粒复作用下进行复制。质粒复制后

48、，分配蛋白与制后，分配蛋白与sopCsopC位位点结合形成分配复合物。点结合形成分配复合物。复制后的质粒均等地分配到两复制后的质粒均等地分配到两个子细胞中，分配后的质粒可个子细胞中，分配后的质粒可能在分配蛋白的作用下，定位能在分配蛋白的作用下，定位于细胞的特定区域。于细胞的特定区域。F质粒基因组中控制寄主致死功能的基因质粒基因组中控制寄主致死功能的基因ccdA和和ccdB，属于同一个自我调节的操纵子，分别编码属于同一个自我调节的操纵子，分别编码8.3kD和和11.7kD的两种蛋白。的两种蛋白。在含质粒的细胞中，在含质粒的细胞中，CcdA蛋白作为解毒剂专门与毒剂蛋白作为解毒剂专门与毒剂CcdB蛋

49、白结合，并使之失效。蛋白结合，并使之失效。在没有在没有CcdA蛋白的情况下，蛋白的情况下，CcdB蛋白通过抑制蛋白通过抑制DNA解解旋酶的活性，或引发解旋酶诱导寄主染色体旋酶的活性，或引发解旋酶诱导寄主染色体DNA发生双链发生双链断裂，从而使染色体在细胞分裂过程中无法进行正确的分断裂，从而使染色体在细胞分裂过程中无法进行正确的分配。配。n寄主致死体系（寄主致死体系（host-killing mechanism）在新产生的无质粒的子细胞中，开始的时候是含有在新产生的无质粒的子细胞中，开始的时候是含有CcdA和和CcdB这两种蛋白质的。这两种蛋白质的。但由于但由于无无ccd操纵子操纵子可发生进一步

50、的转录，因此随后这两可发生进一步的转录，因此随后这两种蛋白质的浓度便逐渐下降。毒剂种蛋白质的浓度便逐渐下降。毒剂CcdB和解毒剂和解毒剂CcdA具具有不同的稳定性，是导致分裂后细胞致死的关键因素。有不同的稳定性，是导致分裂后细胞致死的关键因素。CcdA蛋白质不稳定，易被蛋白水解酶蛋白质不稳定，易被蛋白水解酶(protease)降解，于降解，于是较稳定的是较稳定的CcdB蛋白质便可行使其对寄主细胞的致死作用。蛋白质便可行使其对寄主细胞的致死作用。随机分配：随机分配：是指在细胞分裂过程中质粒拷贝数在两个子细是指在细胞分裂过程中质粒拷贝数在两个子细胞之间是随机分配的。在一般情况下，通过随机分配质粒胞

51、之间是随机分配的。在一般情况下，通过随机分配质粒也能够得到稳定的遗传，但在分裂中也会出现无质粒的子也能够得到稳定的遗传，但在分裂中也会出现无质粒的子细胞。细胞。 2.随机分配机制随机分配机制(random distribution)ColEl等多数高拷贝质粒一般没有等多数高拷贝质粒一般没有par基因，它们依赖于高基因，它们依赖于高拷贝质粒的随机分配来实现分裂过程中的稳定性。拷贝质粒的随机分配来实现分裂过程中的稳定性。但在某些情况下，尤其是在但在某些情况下，尤其是在recA+的宿主细胞中，的宿主细胞中，ColE1常常能彼此重组而形成多聚体能彼此重组而形成多聚体(multimer)，从而使单个细胞

52、内，从而使单个细胞内质粒的拷贝数减少，并增加产生无质粒细胞的可能性。质粒的拷贝数减少，并增加产生无质粒细胞的可能性。另外，另外，ColEl质粒含有不依赖于质粒含有不依赖于recA的的cer基因，负责多聚体基因，负责多聚体的解聚作用，使之重新转变为单体质粒以保证质粒在细胞分的解聚作用，使之重新转变为单体质粒以保证质粒在细胞分裂时的稳定性。裂时的稳定性。人工构建的质粒载体如人工构建的质粒载体如pBR322等，在构建过程中并不携带等，在构建过程中并不携带par区，因此它们在细胞分裂过程中是被随机分配的。区，因此它们在细胞分裂过程中是被随机分配的。尽管在大肠杆菌培养物中出现无尽管在大肠杆菌培养物中出现

53、无pBR322质粒细胞的可能性质粒细胞的可能性较低，但在一定的条件下，如培养基耗尽或是寄主细胞快较低，但在一定的条件下，如培养基耗尽或是寄主细胞快速生长分裂的过程中，仍有可能产生出无质粒的细胞。速生长分裂的过程中，仍有可能产生出无质粒的细胞。因此，人工构建的质粒载体，都必须具有选择性遗传标记因此，人工构建的质粒载体，都必须具有选择性遗传标记如：抗药性、营养缺陷型等，以保持选择压力。如：抗药性、营养缺陷型等，以保持选择压力。质粒转移性：质粒转移性：是指质粒能自动地从一个细胞转移到另一个是指质粒能自动地从一个细胞转移到另一个细胞，甚至还能带动供体细胞的染色体细胞，甚至还能带动供体细胞的染色体DNA

54、向受体细胞转向受体细胞转移，这类质粒常常被叫做自主转移质粒移，这类质粒常常被叫做自主转移质粒(self-transmissible plasmid)。质粒在细菌间的转移，需要供体和受体细胞间的直接接触质粒在细菌间的转移，需要供体和受体细胞间的直接接触才能进行，即接合作用才能进行，即接合作用(conjugation)，这类质粒又被称接合，这类质粒又被称接合质粒质粒(conjugative plasmid)。六、质粒的转移性六、质粒的转移性-分为转移性和非转移性两大类型分为转移性和非转移性两大类型有些质粒虽然不能自主转移，但能被其他一些自主转移质粒有些质粒虽然不能自主转移，但能被其他一些自主转移质

55、粒所转移，这类质粒又被叫做可移动质粒所转移，这类质粒又被叫做可移动质粒(mobilizable plasmid)。质粒质粒拷贝数拷贝数转移性转移性质粒质粒拷贝数拷贝数转移性转移性ColE110-18不能R6k1-2能ColE210-18不能RP44-7能ColE310-18不能pBR322约20不能F 因子1-2能pBR325约20不能R1001-2能几种不同质粒的转移性能几种不同质粒的转移性能 u已知大肠杆菌的已知大肠杆菌的F质粒、质粒、R1、R100、ColV、Collb-P9、R6k、RP4等均属于等均属于自自主转移质粒，它们是低拷贝的大质粒，主转移质粒，它们是低拷贝的大质粒，其中较小的

56、其中较小的R6k质粒也有质粒也有38kb。uG+细菌如链霉菌中的自主转移质粒，除细菌如链霉菌中的自主转移质粒，除SCPl是巨大质粒是巨大质粒外，很多都是外，很多都是10kb左右的小质粒，而与转移有关的区域只左右的小质粒，而与转移有关的区域只有有2kb左右。左右。u自主转移质粒的大小差异可能是因为它们的转移机制不自主转移质粒的大小差异可能是因为它们的转移机制不同，同，G+细菌中质粒的转移不需要性菌毛，因此质粒的容量细菌中质粒的转移不需要性菌毛，因此质粒的容量就较小。就较小。1.自主转移质粒的特点自主转移质粒的特点u许多许多G-细菌中的自主转移质粒需要大于细菌中的自主转移质粒需要大于30kb的的D

57、NA来编来编码与接合转移有关的蛋白质，如码与接合转移有关的蛋白质，如F质粒的转移操纵子质粒的转移操纵子(tra)就就包含包含23个基因，大小为个基因，大小为33 kb。tra基因和基因和oriT在质粒自主转移过程中起着重要作用，所以在质粒自主转移过程中起着重要作用，所以大多数自主转移质粒都有大多数自主转移质粒都有tra基因和基因和oriT位点。位点。 u自主转移质粒能诱导含有与自己相同或相似的自主转移质粒能诱导含有与自己相同或相似的oriT位点位点的非自主转移质粒进行转移，如将自主转移质粒整合到染的非自主转移质粒进行转移，如将自主转移质粒整合到染色体上后，带动染色体转移也是从质粒的色体上后，带

58、动染色体转移也是从质粒的oriT位点开始的。位点开始的。(1) tra基因：基因：大多数大多数tra基因的产物与性菌毛的形成基因的产物与性菌毛的形成(F、RP4和和pKMl01都编码一根性菌毛都编码一根性菌毛)、杂交对的形成有关；、杂交对的形成有关；有些有些tra基因编码作用于基因编码作用于oriT位点的内切酶，使质粒中的一条位点的内切酶，使质粒中的一条DNA链产生切口，从而开始转移；有些链产生切口，从而开始转移；有些tra基因则与质粒转基因则与质粒转移调控等有关。移调控等有关。 (2) oriT位点：位点：oriT位点不仅是质粒转移的起始位点，也是位点不仅是质粒转移的起始位点，也是质粒转移后

59、质粒转移后DNA末端再环化的位点，因此质粒必须具有末端再环化的位点，因此质粒必须具有oriT位点才能进行自主转移。位点才能进行自主转移。2.可移动质粒的特点可移动质粒的特点 G-细菌中可移动质粒缺少与性菌毛合成有关的基因细菌中可移动质粒缺少与性菌毛合成有关的基因( (约约10个个左右左右) ) 。因此，在进行转移时，必须利用位于同一细胞内。因此，在进行转移时，必须利用位于同一细胞内的自主转移质粒编码合成的性菌毛才能进行。的自主转移质粒编码合成的性菌毛才能进行。如如ColEl具有独特的具有独特的bom位点和负责位点和负责DNA转移的转移的mob基因。基因。ColEl的的bom位点类似于位点类似于

60、F质粒的质粒的oriT。mob基因的功能类似基因的功能类似于于tra基因，基因，mob基因也能编码特异的核酸内切酶，在基因也能编码特异的核酸内切酶，在bom位位点进行切割，但没有编码性菌毛的点进行切割，但没有编码性菌毛的tra基因，所以它不能自基因，所以它不能自主转移。主转移。但它们含有与但它们含有与F质粒的质粒的oriT类似的类似的bom位点和可移动基因位点和可移动基因mob(mobilization)，因而能够被带有，因而能够被带有tra基因的质粒诱动转移。基因的质粒诱动转移。 mob产物产物bomF- mobF+ mob bomF+ mob-F+ mob+ bom-不能转移不能转移性菌毛