榄香烯和姜黄素诱导晶状体上皮细胞凋亡的体外研究

1、榄香烯和姜黄素诱导晶状体上皮细胞凋亡的体外研究 08-10-21 14:36:00 编辑：studa20 作者:黄秀榕, 祁明信, 康可人 【关键词】 榄香烯;,姜黄素;,晶状体;,上皮细胞；,凋亡摘要: 目的 探讨榄香烯(Ele)和姜黄素(Cur)对体外培养的牛晶状体上皮细胞(LEC)凋亡的诱导效应及其机制。方法 将培养的牛LEC分别与160 g/mL Ele和20 g/mL Cur在CO2培养箱中共同孵育8,16,24,48,72 h,通过透射电子显微镜观察LEC超微结构;采用流式细胞术(FCM)测定LEC的DNA含量及线粒体跨膜电位(m)。结果 LEC分别与Ele和Cur共同孵育后,电子

2、显微镜下可观察到细胞核染色质凝集、固缩、边集、核碎裂等,均呈现典型的细胞凋亡的形态学改变。FCM分析可见典型的凋亡亚G1峰,提示细胞核内DNA含量下降,并随药物作用时间的延长而加强。FCM检测发现细胞质出现线粒体m下降,且在药物作用早期已发生变化。结论 Ele和Cur能显著诱导LEC凋亡;细胞核内DNA含量下降、细胞质内线粒体m降低,分别是Ele和Cur诱导LEC凋亡的细胞核和细胞质途径。线粒体m下降是Ele和Cur诱导LEC凋亡的早期事件。关键词: 榄香烯; 姜黄素; 晶状体; 上皮细胞； 凋亡ABSTRACT: Objective To investigate the effect and

3、 the mechanism of elemene(Ele) and Curcumin(Cur) on apoptosis of lens epithelial cell(LEC) in vitro.Methods The bovine LEC cultured with 160 g/mL Ele and 20 g/mL Cur were observed by using transmission electron microscopy. The changes of DNA content and mitochondrial transmembrane potential(m) in LE

4、C were detected by flow cytometry. Results The typical morphological changes of LEC apoptosis in Ele and Cur group were observed under transmission electron microscope, such as chromatin condensation and aggregation at the nuclear periphery, and nuclear fragmentation as well. The DNA content of LEC

5、in Ele and Cur group decreased timedependently. The m of LEC in Ele and Cur group decreased from early stage. Conclusion Ele and Cur can remarkably induce apoptosis of LEC in vitro. The decrease of DNA content in LEC nucleus and the collapse of mitochondrial transmembrane potential(m) in cytoplasm a

6、re the nucleu and cytoplasm events of apoptosis mechanisms. The decreased of m induced by Ele and Cur is the early event of LEC apoptosis.KEY WORDS: elemene; curcumin; lens; epithelial cell; apoptosis白内障囊外摘除联合人工晶状体植入术是目前白内障手术的主要方法,其近期疗效已十分肯定。但术后发生的后囊混浊,又称后发性白内障,导致远期视力下降是其主要的并发症之一。白内障术后残留的晶状体上皮细胞(len

7、s epithelial cell,LEC)在晶状体囊膜上的增生、移行、产生胶原,是发生后囊混浊的主要原因。寻求高效低毒的防治后发障的药物具有重大意义1。有研究表明,从中药莪术中提取的挥发油榄香烯(elemene,Ele)可阻滞细胞从DNA合成期(S期)进入合成后期/分裂期(G2/M期),抑制肿瘤细胞增殖并导致细胞凋亡23。从姜科植物的根茎姜黄中提取的姜黄素(curcumin,Cur)具有抗氧化、抗增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤生长等作用,且毒副作用小,故日益受到关注47。笔者采用电子显微镜及流式细胞仪(flow cytometry,FCM),通过观察LEC的凋亡形态改变、检测LEC的DNA

8、含量及线粒体跨膜电位(mitochondrial transmembrane potential,m)的改变,探讨Ele和Cur诱导LEC凋亡及其细胞学和分子生物学机制,为从天然药物中寻求防治后发性白内障的药物提供科学的实验依据。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 试剂 榄香烯乳(大连金港制药有限公司,批号0110113),姜黄素(美国Sigma公司),DMEM培养液(dulbeccos modified eagles medium,美国Gibco公司),胎牛血清(FBS,杭州四季青生物工程材料有限公司),胰蛋白酶(Trypsin,美国Amresco公司),乙二胺四乙酸(EDTA,美国Aug

9、us公司),碘化丙啶(PI,美国Sigma公司),核糖核酸酶A(RNase A,北京华美生物工程公司),细胞凋亡线粒体流式检测试剂盒(MitoCapture mitochondrial apoptosis detection kit,美国Bio Vision公司)。1.1.2 仪器 二氧化碳培养箱(3112A,美国Forma公司),透射电子显微镜(Hu12A,日本日立公司),倒置相差显微镜(日本Olympus公司),低温冰箱(日本Sanyo公司),流式细胞仪(FACScan,美国BD公司),微量移液器(法国Gilson公司),细胞培养皿及细胞培养瓶(丹麦NUUC公司)。1.2 方法1.2.1

10、晶状体上皮细胞原代和传代培养 取健康新鲜小牛眼,无菌操作撕取晶状体前囊膜,采用贴壁法在二氧化碳培养箱中进行细胞原代和传代培养。1.2.2 分组 (1)正常组:DMEM维持液3 mL(含5%FBS,青霉素100 U/mL,链霉素100 g/mL);(2)H2O2组:DMEM维持液+30%H2O2(终浓度为300 mol/L),每8 h加入首次量的60%,以保持培养液中H2O2浓度为300 mol/L;(3)Ele组:按作用时间分成Ele 8,16,24,48和72 h组,每组含DMEM维持液+Ele(终浓度160 g/mL);(4)Cur组:按作用时间分组同Ele组,每组含DMEM维持液+Cur

11、(终浓度20 g/mL)。 取生长良好的第35代LEC细胞传代于50 mL培养瓶中,常规培养48 h后,细胞处于对数生长期。按上述分组加入不同药物,并置二氧化碳培养箱孵育。Ele和Cur分别作用8,16,24,48和72 h。经不同作用时间后,收集细胞进行检测。1.2.3LEC超微结构制片 取正常组及Ele 24,48,72 h组和Cur 24,48,72 h组的LEC,消化,离心(1000 r/min5 min),去培养液,收集细胞约1106mL1。将离心后的细胞于3%戊二醛1.5%多聚甲醛混合液中固定,4 过夜。1%锇酸后固定,醋酸铀快染,乙醇丙酮脱水,环氧树脂618包埋,超薄切片,醋酸铀

12、和枸橼酸铅双重染色。透射电子显微镜75 kV条件下观察细胞超微结构,摄影。1.2.4 Ele和Cur对LEC核DNA含量的影响 取正常组、H2O2组、Ele 24,48,72 h组和Cur 24,48,72 h组的细胞,参照文献8FCM测定DNA含量方法,用DNA结合染料PI染色后经FCM分析,可在G1峰前出现一亚G1峰,即凋亡峰(蓝色波峰),根据凋亡峰的百分率可检测出凋亡率。凋亡率高,表示DNA含量降低多、细胞凋亡多。1.2.5 检测LEC m改变 于LEC孵育8,16,24,48和72 h收集正常组、H2O2组、Ele组和Cur组的1106mL1细胞,按细胞凋亡线粒体流式检测试剂盒(美国Bio Vision公司)的检测方法,取线粒体试剂1 L稀释到预暖的孵育缓冲液1 mL中,在微型旋蜗混合仪上振荡溶液2 min,离心(12000 r/min,1 min),转移上清,去除颗粒及干扰碎片。将上清液重悬细胞在CO2培养箱中避光孵育1520 min。离心(