分子荧光光谱法2012

1、分子荧光光谱法分子荧光光谱法郑秀玉 分子荧光光谱法又称分子发光光谱法分子荧光光谱法又称分子发光光谱法或荧光分光光度法，即通常所谓的荧光分析或荧光分光光度法，即通常所谓的荧光分析法。该法是一种利用某一波长的光线照射试法。该法是一种利用某一波长的光线照射试样，使试样吸收这一辐射，然后再发射出波样，使试样吸收这一辐射，然后再发射出波长相同或波长较长的光线的化学分析方法。长相同或波长较长的光线的化学分析方法。 定性定性定量定量 分子吸收了紫外分子吸收了紫外-可见光的辐射后，它的电子能级跃可见光的辐射后，它的电子能级跃迁至激发态，然后以热能形式将这一部分能量释放出来，迁至激发态，然后以热能形式将这一部分

2、能量释放出来，本身又回复到基态。如果吸收辐射能后处于电子激发态的本身又回复到基态。如果吸收辐射能后处于电子激发态的分子以发射辐射的方式释放这一部分能量，再发射的波长分子以发射辐射的方式释放这一部分能量，再发射的波长可以同分子所吸收的波长相同，也可以不同。可以同分子所吸收的波长相同，也可以不同。一、光致发光（一、光致发光（Photoluminescent）荧光（荧光（Fluorescence）：）：当激发光停止照射后，发光过程当激发光停止照射后，发光过程几乎立即停止（几乎立即停止（10-910-6秒）。秒）。磷光（磷光（Phosphorescence）：）：将持续一段时间（将持续一段时间（ 10

3、-310秒）。秒）。二、荧光、磷光产生原理二、荧光、磷光产生原理 1、分子的激发态、分子的激发态单重激发态和三重激发态单重激发态和三重激发态 大多数分子含有偶数电子，在基态时，这些电大多数分子含有偶数电子，在基态时，这些电子成对地存在于能量最低的各个原子或分子轨道中，子成对地存在于能量最低的各个原子或分子轨道中，根据根据Pauli不相容原理，一个给定轨道中的两个电子，不相容原理，一个给定轨道中的两个电子，必定具有相反方向的自旋，即自旋量子数分别为必定具有相反方向的自旋，即自旋量子数分别为1/2、-1/2，电子总自旋量子数等于零：，电子总自旋量子数等于零：S=+(-)=0，即基态没有净自旋，其电

4、子能态的多重性，即基态没有净自旋，其电子能态的多重性 M=2S+1=1 (M 为磁量子数为磁量子数)，因此，基态的多重性，因此，基态的多重性为为1，分子是抗（反）磁性的，其能级不受外界磁，分子是抗（反）磁性的，其能级不受外界磁场影响而分裂，称场影响而分裂，称“单重态单重态”。单重态单重态：单重激发态：单重激发态： 当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后，当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后，被激发跃迁到能量较高的轨道上，通常它的自被激发跃迁到能量较高的轨道上，通常它的自旋方向不改变，即两个电子的自旋方向仍相反，旋方向不改变，即两个电子的自旋方向仍相反，总自旋量子数总自旋量子数S=0， M=2S+

5、1=1，则分子处于的激则分子处于的激发态仍是单重态，即发态仍是单重态，即“单重激发态单重激发态”。 如果电子在跃迁过程中，还伴随着自旋方向的如果电子在跃迁过程中，还伴随着自旋方向的改变，这时便具有两个自旋不配对的电子，即两改变，这时便具有两个自旋不配对的电子，即两个电子的自旋量子数都为个电子的自旋量子数都为1/2，电子总自旋量子数电子总自旋量子数不等于零，而等于不等于零，而等于1： S=1/2+1/2=1 ，其多重性：，其多重性： M=2S+1=3，即分子在磁场中受到影响而产生能级即分子在磁场中受到影响而产生能级分裂，这种受激态称为分裂，这种受激态称为“三重激发态三重激发态”。三重激发态：三重

6、激发态：2、分子去活化过程及荧光的发生、分子去活化过程及荧光的发生 一个分子的外层电子能级一个分子的外层电子能级包括包括 S0（基态）和第（基态）和第1至第至第 n的的电子激发的单重激发态电子激发的单重激发态S1，S2，. Sn ，第第1至第至第 n的电子的电子激发的三重激发态激发的三重激发态T1. Tn ，每个电子能级又包括一系列能每个电子能级又包括一系列能量非常接近的振动能级。量非常接近的振动能级。S0S1T1SnTn. 分子吸收了紫外分子吸收了紫外-可见光后，基可见光后，基态分子中的电子只能跃迁到激发单态分子中的电子只能跃迁到激发单重态的不同振动能级上，根据自旋重态的不同振动能级上，根据

7、自旋禁律，不能直接跃迁到激发三重态禁律，不能直接跃迁到激发三重态的各个振动能级上。的各个振动能级上。 处于激发态的分子不稳定，在较处于激发态的分子不稳定，在较短的时间内可通过不同途径释放多余短的时间内可通过不同途径释放多余的能量（辐射或非辐射跃迁）回到基的能量（辐射或非辐射跃迁）回到基态，这个过程称为态，这个过程称为“去活化过程去活化过程”。 1. 振动弛豫：在溶液中，处振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞，把一部分分子间发生碰撞，把一部分能量以热的形式迅速传递给能量以热的形式迅速传递给溶剂分子（环境）回到同一溶剂分子（环境）回到同一电子激发态的

8、最低振动能级。电子激发态的最低振动能级。去活化过程去活化过程2. 系间跨跃：当电子单重激系间跨跃：当电子单重激发态的最低振动能级与电子发态的最低振动能级与电子三重激发态的较高振动能级三重激发态的较高振动能级相重叠时，发生电子自旋状相重叠时，发生电子自旋状态改变的态改变的 ST 跃迁，这一跃迁，这一过程称为过程称为 “系间跨跃系间跨跃” 。4.外转换：激发态分子与溶剂分子或其他溶质分子相互作用外转换：激发态分子与溶剂分子或其他溶质分子相互作用而以非辐射形式转移掉能量回到基态的过程。而以非辐射形式转移掉能量回到基态的过程。S1S23. 内转换：当激发态内转换：当激发态S2 的较低振动能级与的较低振

9、动能级与S1 的较高振动能的较高振动能级的能量相当或重叠时，分子有可能从级的能量相当或重叠时，分子有可能从S2 的振动能级以无的振动能级以无辐射方式过渡到辐射方式过渡到S1 的能量相等的振动能级上，的能量相等的振动能级上， 这一无辐射这一无辐射过程称为过程称为“内转换内转换”。内转换内转换例如：紫外可见分光光度计中，分子吸收紫外例如：紫外可见分光光度计中，分子吸收紫外-可见光产生可见光产生吸收光谱，当从激发态回到基态时就是一个外转换的过程。吸收光谱，当从激发态回到基态时就是一个外转换的过程。5. 荧光发射：当激发态的分子荧光发射：当激发态的分子通过振动驰豫通过振动驰豫内转换内转换振动驰豫到达单

10、重激发态的最振动驰豫到达单重激发态的最低振动能级时，单重激发态最低振动能级时，单重激发态最低振动能级的电子可通过发射低振动能级的电子可通过发射辐射（光子）跃回到基态的不辐射（光子）跃回到基态的不同振动能级，此过程称为同振动能级，此过程称为 “荧荧光发射光发射”。6. 磷光发射：三重激发态最磷光发射：三重激发态最低振动能级的分子以发射辐低振动能级的分子以发射辐射（光子）的形式回到基态射（光子）的形式回到基态的不同振动能级，此过程称的不同振动能级，此过程称为为 “磷光发射磷光发射”。 由于三重态寿命较长，因而发生振动弛豫及外转换的几率由于三重态寿命较长，因而发生振动弛豫及外转换的几率也高，失去激发

11、能的可能性大，以致在室温条件下很难观也高，失去激发能的可能性大，以致在室温条件下很难观察到溶液中的磷光现象。因此，试样采用液氮冷冻降低其察到溶液中的磷光现象。因此，试样采用液氮冷冻降低其它去活化才能观察到某些分子的磷光。它去活化才能观察到某些分子的磷光。 处于激发态的分子，可以通过上述不同途径回到基态，处于激发态的分子，可以通过上述不同途径回到基态， 哪哪种途径的速度快，哪种途径就优先发生。种途径的速度快，哪种途径就优先发生。 如果发射荧光使受激分子去活化过程与其他过程相比较快，如果发射荧光使受激分子去活化过程与其他过程相比较快，则荧光发生几率高，强度大。则荧光发生几率高，强度大。 如果发射荧

12、光使受激分子去活化过程与其他过程相比较慢，如果发射荧光使受激分子去活化过程与其他过程相比较慢，则荧光很弱或不发生。则荧光很弱或不发生。三三、激发光谱与荧光光谱、激发光谱与荧光光谱 1 1、激发光谱、激发光谱 将激发荧光的光源用单色器分光，连续改变激发光将激发荧光的光源用单色器分光，连续改变激发光波长，固定荧光发射波长，测定不同波长激发光下物质波长，固定荧光发射波长，测定不同波长激发光下物质溶液发射的荧光强度溶液发射的荧光强度(F)，以激发光的波长为横座标，以激发光的波长为横座标，荧光强度为纵座标作荧光强度为纵座标作Fl光谱图光谱图，便可得到荧光物质的，便可得到荧光物质的激发光谱。激发光谱。 从

13、激发光谱图上可找到发生荧光强度最强的激发波从激发光谱图上可找到发生荧光强度最强的激发波长长lex，选用选用 lex可得到强度最大的荧光。可得到强度最大的荧光。2 2、荧光光谱、荧光光谱 如果保持激发光的波长和强度不变，测量不同波长处荧如果保持激发光的波长和强度不变，测量不同波长处荧光的强度分布，将荧光的波长为横座标，荧光强度为纵座标光的强度分布，将荧光的波长为横座标，荧光强度为纵座标作作F- l 光谱图光谱图便得到荧光光谱或称发射光谱。便得到荧光光谱或称发射光谱。 倍频峰 荧光光谱中荧光强度最强的波长为荧光光谱中荧光强度最强的波长为 lem 。四、溶液荧光光谱特征四、溶液荧光光谱特征1、斯托克

14、斯位移、斯托克斯位移 在溶液荧光光谱中，在溶液荧光光谱中，荧光波长总是大于激发光荧光波长总是大于激发光波长。激发与发射之间存波长。激发与发射之间存在着一定的能量损失。在着一定的能量损失。2、荧光光谱的形状与激发波长无关、荧光光谱的形状与激发波长无关 3、荧光光谱与激发光谱呈镜像关系、荧光光谱与激发光谱呈镜像关系荧光光谱的形状和吸收光谱的形状十分相似，且互为镜像。因为吸收光谱中第一吸收带是物质分子由基态激发至第一激发态的各振动能级所致，所以其形状决定于第一激发态中振动能级的分布情况；而荧光光谱是由受激分子从第一激发态的最低振动能级降落至基态中各个振动能级所致，所以荧光光谱的形状决定于基态中振动能

15、级的分布情况。基态中振动能级的分布和第一电子激发态中的振动能级分布是相类似的，所以荧光光谱的形状与吸收光谱十分相似。又因为当电子从基态的最低振动能级跃迁到第一激发态的各个振动能级中，以激发到最高振动能级时吸收光能最大，吸收波长最短；而电子从第一激发态的最低振动能级下降到基态的各振动能级中，如果基态的振动能级也是最高，则发射能量最小，相应的荧光波长最长。当电子从基态的最低振动能级激发到第一激发态的最低振动能级时，吸收的光能最小，相应的吸收波长最长，而当电子从第一激发态的最低振动能级下降到基态的最低振动能级时，发射的能量最大，相应的荧光波长最短。所以荧光光谱和吸收光谱不但形状相似而且互为镜像。 物

16、质分子结构与荧光的发生及荧光强度紧密相物质分子结构与荧光的发生及荧光强度紧密相关，根据物质的分子结构可判断物质的荧光特性。关，根据物质的分子结构可判断物质的荧光特性。 五、五、荧光与分子结构的关系荧光与分子结构的关系 分子能产生荧光或磷光，首先要求分子结构分子能产生荧光或磷光，首先要求分子结构能吸收紫外和可见辐射。通常，分子吸收辐射的能吸收紫外和可见辐射。通常，分子吸收辐射的能力愈强，则产生的荧光或磷光也愈强。能力愈强，则产生的荧光或磷光也愈强。荧光体系：几乎都是含有一个或几个苯环的复杂荧光体系：几乎都是含有一个或几个苯环的复杂的有机化合物。的有机化合物。 在这些化合物中能产生最强荧光的吸收过

17、程在这些化合物中能产生最强荧光的吸收过程通常包含有通常包含有 *跃迁而达到电子激发态的。跃迁而达到电子激发态的。六、分析方法六、分析方法 波长扫描波长扫描 时间扫描时间扫描 3-D扫描扫描 1 1、波长扫描、波长扫描 给定发射波长，在激发波长的某一范围内进行扫描。给定发射波长，在激发波长的某一范围内进行扫描。 EX波长：波长：200-900 nm EM 开始波长：开始波长：200890nm EM 结束波长：结束波长：210900nm EM波长：波长：200-890 nmEX 开始波长：开始波长： 200890nmEX 结束波长：结束波长：210900nm给定激发波长，在发射波长的某一范围内进行

18、扫描。给定激发波长，在发射波长的某一范围内进行扫描。2 2、时间扫描、时间扫描EX波长：波长：200-900 nmEM波长：波长：200-900 nm 给定激发波长和发射波长，扫描一段时间。给定激发波长和发射波长，扫描一段时间。3、3-D扫描扫描 EX 开始波长：开始波长：200850nmEX 结束波长：结束波长：200900nmEX采样间隔：采样间隔：150nm EM 开始波长：开始波长：200850nmEM 结束波长：结束波长：200900nmEM采样间隔：采样间隔：110nm 等高线的间隔：等高线的间隔：0.011000 在激发波长和发射波长的给定范围内进行扫描。在激发波长和发射波长的给

19、定范围内进行扫描。 七七、荧光强度与溶液浓度的关系荧光强度与溶液浓度的关系 (一一)定量依据定量依据 If=2.3fI0bc（荧光物质浓度很小）荧光物质浓度很小）式中：式中：f为荧光效率，为荧光效率，I0为激发光的强度，为激发光的强度，荧光物荧光物质的摩尔吸收系数，质的摩尔吸收系数，b为试样池的光程为试样池的光程，c为荧光物为荧光物质的浓度质的浓度。 在一定条件下，在一定条件下，f、I0、b均为常数：均为常数： If=Kc（二）定量方法（二）定量方法1 1. . 标准曲线法标准曲线法 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未

20、知试样的荧光强标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出未知试样的浓度。度，在标准曲线上求出未知试样的浓度。XSXSCCII2. 比较法比较法 在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度（3）荧光定性分析）荧光定性分析 将实验测得样品的荧光激发光谱和荧将实验测得样品的荧光激发光谱和荧光发射光谱与标准荧光光谱图进行比较来光发射光谱与标准荧光光谱图进行比较来鉴定样品成分。鉴定样品成分。八、荧光分析法的应用八、荧光分析法的应用 由于分子荧光分析法的选择性和灵敏性由于分子荧光分析法的选择性和灵敏性好，常应用于医药、食品、生物化学和天然好，常应用于

21、医药、食品、生物化学和天然产物的分析。在有机物分析方面应用较多。产物的分析。在有机物分析方面应用较多。 目前荧光分析大多用于定量分析，由于目前荧光分析大多用于定量分析，由于自身发射荧光的化合物不多，因此往往利用自身发射荧光的化合物不多，因此往往利用有机试剂与荧光较弱或不显荧光的物质结合有机试剂与荧光较弱或不显荧光的物质结合形成发荧光的配合物来进行测定。形成发荧光的配合物来进行测定。(1)无机化合物的分析无机化合物的分析与有机试剂形成配合物后测量；可测量约与有机试剂形成配合物后测量；可测量约6060多种多种元素。元素。（2 2）有机化合物的分析）有机化合物的分析 芳香族化合物具有共轭的不饱和结构，多能发生荧光，可以芳香族化合物具有共轭的不饱和结构，多能发生荧光，可以直接进行荧光测定；而脂肪族化合物的分子结构较简单，本身能直接进行荧光测定；而脂肪族化合物的分子结构较简单，本身能发荧光的很少，须与某些试剂反应后才能进行分析。发荧光的很少，须与某些试剂反应后才能进行分析。八、磷光分析法及应用八、磷光分析法及应用与荧光相比，