新穿膜融合蛋白His-T1-绿色荧光蛋白的跨膜效率及其对细胞存活的影响

1、 # Chin J Pharmacol Toxicol 2008 Apr; 22(2)新穿膜融合蛋白His-Tl-绿色荧光蛋白的跨膜效率及其对细胞存活的影响王 怡'，林海环'，杨 静'，姜丽娟'，李校埜卩(1.温州医学院药学院，浙江温州325035； 2.教育部生物反应器与药物开发工程研究中心，吉林长春130000) # Chin J Pharmacol Toxicol 2008 Apr; 22(2) # Chin J Pharmacol Toxicol 2008 Apr; 22(2)摘要：目的 研究穿膜融合蛋白His-Tl-绿色荧光 蛋白(GFP)的跨膜效率及

2、其对细胞存活的彩响°方 法 以浓度为500 mgL“的HisTlGFP与人鼻咽 癌CNE2或大鼠肾小管上皮NRK52E细胞蒔育6 h, 应用荧光显微镜观察His-Tl-GFP跨膜进入细胞的 情况。应用多功能酶标仪检测细胞荧光强度，研究 His-Tl-GFP痔膜的动力学因索：以浓度为500 mg L"的HisTlCFP与CNE2或NRK52E细胞蒔育 10 min至24 h,观察解育时间对穿膜作用的影响；以 浓度为 25 mg-L_,至 1.0 g-L_,的 His-Tl-GFP 与两 种细胞蜉育6 h,观察蛋白浓度对跨膜效率的彩响； 以浓度为500 mg-L_,的His-T

3、l-GFP与两种细胞分 别在4弋和37龙的条件下蒔育6 h,观察温度对蛋白 跨膜效率的形响，用细胞乳酸脱氢酶(LDH)试剂 盒和MTT法来评价5.0 gL"浓度的His-Tl-GFP对 细胞存活的彩响，结果在一定浓度范国内，His T1-GFP能够有效穿透CNE2和NRK52E细胞膜，且 对NRK52E细胞的跨膜效率明显高于His-TAT- GFP。His-Tl-GFP在10 min内就能有效跨膜进入 细胞，并且在6 h内进入细胞的量与时间成正相关。 在一定浓度范團(25 mg-L-1 1.0 gL")内，该蛋 白进入细胞的量与自身浓度成正相关，而在4弋时 该蛋白仍具有跨膜

4、能力°当其终浓度离达5.0 g- L"时，对CNE2和NRK52E两种细胞几乎无毒性作 用，结论 His-Tl-GFP蛋白是一种跨膜效率高且 低毒的穿膜融合蛋白9关键词：穿膜肽；融合蛋白，HisTl绿色荧光蛋白； 细胞膜通透性；细胞毒性中图分类号:R962 文献标识码：A 文章 编号：10003002(2008)02412947穿膜肽(cell-penetrating peptides, CPP)是一类 能够穿透细胞膜进入细胞质甚至细胞核，而不损坏 细胞膜结构的小分子多肽(其长度一般不超过30 个氨基酸)。近几年来，已经证实CPP能够运载一 系列包括多肽、蛋白、核酸和寡聚核

5、昔酸等具有不同 生物活性的物质进入活细胞。虽然CPP融合有 治疗作用的“货物分子”具有潜在的广泛临床应用 价值,但是它在细胞和组织中的转运效率、生物利用 度和生物安全性还有待进一步研究。由11个氨基酸(YGRKKRRQRRR)组成的Tat 蛋白转导域(Tat protein transduction domain, TAT) 来源于HIV-1的反式激活蛋白,是一种在蛋白转导 过程中能高效穿过生物膜的结构域，它能将与其共 价连接的多肽、蛋白质及DNA等分子跨膜导入几乎 所有的组织和细胞，甚至可以通过血脑脊液屏障, 转导效率高而且对细胞无明显损伤dr】。在之前的 研究中，根据穿膜肽的构效关系设计了

6、 TAT的改构 体T1,其氨基酸一级结构为RRRKKRRRR7°通 过基因克隆技术，成功地在大肠杆菌表达系统中表 达了 N端融合His标签(组氨酸标签)、C端融合绿 色荧光蛋白(green fluorescence protein, GFP)报导 蛋白即His-Tl-GFP融合蛋白。通过荧光显微镜、免 疫组化等手段观察发现融合蛋白His-Tl-GFP经静 脉注射后,能够穿透小叡血-脑脊液屏障进入大脑皮 质和海马。因此进一步研究His-Tl-GFP在体外 对人鼻咽癌CNE2细胞和大鼠肾小管上皮NKK52E 细胞的跨膜效率，考査该蛋白对这两种细胞的毒性作用，初步探讨其跨膜递送动力学特征及

7、内在化机 制'1材料与方法1.1试剂及仪器RPMI-1640培养基,Gibco公司；小牛血清,杭州 四季青生物工程材料研究所;唾理蓝（MTDJluck 公司；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）试剂 盒,南京建成生物工程研究所;融合蛋白His-TAT- GFP（阳性对照）、His-Tl -GFP及His-GFP （阴性对 照）根据已报道的方法通过大肠杆菌发酵，冻干 粉保存:使用前称取适量的蛋白冻干粉,用含有0. 4%小牛血清的饥饿KPM1-1640培养基溶解，用直 径0.22 pun的滤膜过滤除菌后使用°Spectra Max M5 多功能酶标仪

8、，Molecular Devices公司；荧光倒置DIC相差显微镜TE2000-S, Nikon公司312细胞株CNE2细胞由中山大学馈赠；NRK52E细胞由 中山大学肾病研究所馈赠13细胞培养CNE2细胞和NKK52E细胞分别于37七,5%CO2 条件下培养在含有10% （ V/V）小牛血清的KPMI-1640 培养基中,细胞贴壁生长良好。取经0.25%胰蛋白酶 消化后的CNE2和NRK52E细胞用KPMI-1640培养 液（含10%小牛血清）配成1 x 109 L的悬液，接种于 24孔细胞培养板中（每孔1 mL）,于37T：,5%CO2条 件下贴壁过夜生长,作为待用细胞1.4不同细胞对Hi

9、s-Tl-GFP跨膜递送的影响取待用细胞，分别加入3种蛋白：His-TAT- GFP,His-Tl-GFP 和 His-GFP 至终浓度 500 mg-L_,0 37r,5%CO2条件下孵育6肌 实验分3组:阳性对 照组为蛋白His-TAT-GFP,实验组为蛋白His-Tl- GFP,阴性对照组为His-GFP；每组平行设定3孔: 孵育结束后用4弋pH 7.4的PBS清洗3次，小心吸 除PBS,4%多聚甲醛固定10 min3蒸tg水清洗3次 后室温凉干，荧光显微镜镜检01.5影响HisTlGFP跨膜递送动力学的因素 1.5.1作用时间取待用细胞，融合蛋白His-Tl-GFP以终浓度 500 m

10、g-L'1,于37T,5%CO2条件下分别孵育10, 30 min及1,3,6和24 h。孵育结束后用 代 的pH 7.4的PBS清洗3次，小心吸除PBS,4%多聚甲醛 固定10 min0蒸tg水清洗3次后室温凉干，多功能 酶标仪检测荧光强度，激发波长为395 mn,发射波 长为509 mn,底部读板，1.5.2蛋白浓度取待用细胞，融合蛋白His-Tl-GFP以终浓度为 25,50,100,500和1000 mg-L'1分别加入贴壁过夜 生长的CNE2和NRK52E细胞，在37r,5%CO2条 件下殍育6 h。孵育结束后用4弋pH 7.4的PBS清 洗3次，小心吸除PBS,4%

11、多聚甲醛固定10 minc 蒸憎水清洗3次后室温凉干，多功能酶标仪检测荧 光强度，激发波长为395 nm,发射波长为509 nm,底 部读板。1.5.3作用温度取待用细胞，融合蛋白His-Tl-GFP以终浓度 500 mg-L-1分别加入贴壁过夜生长的CNE2和 NRK52E细胞后，分别于37七和4七下孵育6 h。孵 育结束后用4七pH 7.4的PBS清洗3次，小心吸除 PBS,4%多聚甲醛固定10 min0蒸惚水清洗3次后 室温凉干,多功能酶标仪检测荧光强度，激发波长为 395 rnn,发射波长为509 nm,底部读板二1.6 His-Tl-GFP的细胞毒性16.1 LDH酶活性方法检测对细

12、胞膜完整性的影响取待用细胞,His-Tl-GFP及His-TAT-GFP分别 以终浓度5 gL"分别加入贴壁过夜生长的CNE2 和NRK52E细胞，空白对照孔中加入含有0. 4%小 牛血清的KPMI-1640饥饿培养液,37T,5%CO2孵 育24 h0使用LDH试剂盒测定LDH的含量：在 440 nm处，1 cm光径,空白试管调零，测各管吸光 度，查标准曲线，求LDH酶活性。全部比色在5 15 min完成，避免读数降低。LDH的活性用UL" 表示。1 6.2 M1T法检测对细胞增殖的影响将生长旺盛的CNE2和NRK52E细胞经0. 25% 胰蛋白酶消化后，用RPMI-16

13、40培养液（含10%小牛 血清）配成5 x 108 L"的悬液，加入96孔圆底细胞培 养孔内，每孔100 pL,置37,5% CO?条件下培养 24 h后，弃培养上清，用37兀预温的RPM1-1640培养 液洗1次;每孔加入100 rL含有0.4%小牛血清的饥 饿KFMI-1640培养液（含0. 4%小牛血清），置371, 5%C（）2条件下饥饿培养24 h后弃培养上清，每孔加 A 0.1 inL浓度为5 g-f*融合蛋白His-TAT-GFP和 His-Tl-GFP0空白对照孔中加入RPM1-1640饥饿培 中国跖理学与4理学杂志2008年4月；22(2)-131 养液0.1 mL

14、海个样品做3个平行。37七,5%CO2孵 育 24h。每孔加A20|iLpH7.4PBS 配制的 5 g-f1 MTT,再置37七,5%CO2孵育4 h；取出，甩脱上清，每 孔加0.2 mL预温RPMI-1640培养液清洗一遍;每孔 加入0. 15 mL二甲亚矶混匀,30 min后在酶联检测仪 上570 nm波长处测吸光度(absorbance, 4 )值，空白 试剂调零:细胞活性(%)=实验组值/对照组 G)帕值 X100%。1.7方法1.5.3得出的数据使用两样品均数比较 的t检验进行统计学分析;方法1.6.1及方法1.6.2 得岀的数据使用单因数方差分析进行统计学分析； 两种统计方法的检

15、验标准均为a =0.05。2结果2.1 His-Tl-GFP可有效跨过不同细胞的细胞膜 如图1及图2所示,His-TAT-GFP和His-Tl-GFP组均有效穿透视野内所有CNE2和NKK52E细中国跖理学与4理学杂志2008年4月；22(2)-# 中国跖理学与4理学杂志2008年4月；22(2)-# 中国跖理学与4理学杂志2008年4月；22(2)-# 中国跖理学与4理学杂志2008年4月；22(2)-# Fig 1. Cell penetrating efficiency of His-Tl GFP to CNE2 cells ( x20). GFP： green fluorescence

16、 protein. TAT: Tat protein transduction domain. A| and A2 : His-T/T-GFP group; Bj and B2: His-Tl-GFP group; Ct and Cj : His-GFP group. The concentration of the 3 fusion proteins was 500 mg*L 1 the incubation time was 6 h. A, , Bt and C| were captured with visible light9 and A2 , B2 and C2 were captu

17、red with fluorescent light.Fig 2. Cell penetrating efficiency of His-Tl-GFP to NRK52E cells ( x200). A； and A2： His-TAT-GFP group； Bt and B2 : His-Tl-GFP group; Cjand C2 : His-GFP group. The concentrations of the 3 fusion i<otein« was 500 mg*L-1 f the incubation time was 6 h At, B and C】were

18、 captured with visible light, and , B2 and Cj were captured with fluorescent light.中国跖理学与#理学杂志 2008年4月；22(2)#胞的细胞膜进入细胞内，并主要定位于细胞核内。 His-Tl-GFP蛋白在与NRK52E细胞作用时,通过荧 光强度的比对，蛋白His-Tl -GFP比His-TAT-GFP蛋 白具有更明显的穿膜效率:而阴性对照His(FP蛋 白及KPM1-1640培养液空白对照在荧光镜下没有 看见细胞内有明显荧光，提示它们没有细胞穿透能 力。2.2蛋白浓度、作用时间及温度对His-Tl-GFP跨

19、膜递送动力学的影响如表1所示,His-Tl-GFP在一定作用时间内 (10 min-6 h)进入细胞的量与时间成正相关。如 表2所示，在一定浓度范围(25-1000 mgL)内， 蛋白进入细胞的量与自身浓度成正相关。表3结Tab 1. Time affects transmembrane efficiency of His-Tl-GFPTime/minTransmembrane efficiency (FI)NRK52E cellCNE2 ceU101055 ±101055 ±4301112±91124±3601993 ±22426 ±

20、;111802699 ±92659 ±63602830 ±62879 ±914402649 ±182747 ±11H: fluorescence intensity ihe cells were treated with 500 mg* L'1 His-Tl-GFP at 37TL x ±sf n =3. There is no significant difference between the cell lines. NRK52E： F = 0. 794X + 1781.239, r =0.542； CNE2：K

21、 = 0. 785X + 1876 310, r = 0.519.Tab 2. Concentration affects transmembrane efficiency of His-Tl-GFPTab 3 Temperature affects transmembrane efTiciencv of His-Tl-GFPerTemperature/Transmembrane efficiency (FI)NRK52E cellCNE2 cell42165 ±52306 ±5372175 ±ir2346 ± 17 wThe cells were tr

22、eated with 500 mg L'1His-Tl-GFP for 6 h.i ± j, n = 3.pvO.OS, " P < 0 01, compared with 4七 group There is no significant difference between the cell lines 果表明，该融合蛋白在4%时跨膜能力受到部分抑 制：在NRK52E细胞实验中,43C和37%条件下Hi$ T1-GFP的跨膜递送能力有统计学差异,4七时跨膜 递送能力比37弋时降低0.99%；在CNE2细胞实验 中,4七和37汇条件下His-Tl-GFP的跨膜

23、递送能力 有显著性差异,4弋时跨膜递送能力比31X.时降低2. 5%0但是在4弋时,His-Tl-GFP仍可以明显跨膜进 入细胞，温度对该蛋白的跨膜能力影响校小。2.3融合蛋白His-Tl-GFP对细胞存活的影响 2.3.1对细胞膜完整性的影响由于细胞膜完整的细胞，其胞内的LDH基本不 能从细胞内漏出;而细胞膜破裂的细胞，由于细胞内 的LDH漏出细胞外,使得培养液中LDH的量大为 增加，通过测定培养液中LDH的活性可以判断细胞 膜的完整性，由表4可见，浓度高达5 g-L'1的His TAT-GFP 及 H4T1-GFP 分别对 CNE2 和 NRK52E 细胞作用24 h后，细胞培养液

24、中的LDH稍多于空 白对照组,但经单因数方差分析,3种处理方法细胞 培养液中LDH活性无显著性差异，表明5 g-L-*的 His-Tl -GFP对CNE2及NRK52E细胞膜几乎无破坏 作用。中国跖理学与#理学杂志 2008年4月；22(2)133His-Tl-GFP/ 吨L-Transmembrune efficiency (FI)NRK52E ceUCNE2 ceU25154 ±4150 ±250235 ±11232 ± 10100534 ±24526 ±185003030 ± 803110±401000660

25、0x1106760 x130The cells were treated with His-Tl-GFP at 37弋 for 6 h. i ±s9 n =3 There is no significant difference between the cell lines NRK52E：r = 0. 785X - 107. 818, r = 0. 999； CNE2： Y = 6. 798X-121.789, r =0.999.Tab 4. Effect of fusion proteins on integrity of cell membraneFusion proteinLD

26、H/U-f1NRK52E ceUCNE2 ceUHis-TAT-GFP0.180 ±0.0100.174 ±0.010His-Tl-GFP0.169 ±0.0100.170 ±0.010llis CFP0.164 ±0.0100. 160 ±0.010The cells were treated with 5 g L'1 protein at 37乜 for 24 h The activity of LDH efflux was expressed as the cell membrane integrity x ±

27、s9 n = 3 There is no significant difference among the 3 groups.2.3.2对细胞增殖的影响表5所示,与加入0. 4%小牛血清的饥饿培养 基比较，终浓度为5 g-L'1的His-TAT-GFP和His T1-GFP对2种细胞的增殖能力无影响。这一结果 也从另一个侧面说明高浓度(5 g-L-1)的HisTAT GFP和His-Tl-GFP在跨膜递送的过程中对细胞膜 无损伤:Tab 5. Effect of fusion proteins on cell proliferationFusion proteinCell prolif

28、eration/%NRK52E cellCNE2 ceUHis-TAT-GFP100.8±2.0100.0±4.0His-Tl-GFP100.0±0.0100.1 ±1.0His-GFP101.5±2.4100.0±0.0The cells were treated with 5 g* L 1 protein at 37汇 for 24 h. The cell proliferation was determined with MTT assay, x ± s 9 n =3 There is no significant d

29、ifference among the 3 groups.3讨论以前研究认为,TAT介导的蛋白转导过程和蛋 白转导域中的带有强正电荷的碱性氨基酸(精氨酸 和赖氨酸残基)有关t-91o展开的TAT及货物分子 融合蛋白与带有负电荷的细胞膜相互反应，然后直 接发生转膜进入细胞内。进入细胞内后，融合蛋白 在伴侣分予系统的辅助下重新进行蛋白折叠恢复其 原来的蛋白构型3】。然而，随后的研究对TAT的 直接穿膜作用提出质疑，认为其内在化的机制依赖 于巨噬细胞的胞饮作用】和网格蛋白依赖性的内 吞作用叭CPP T1是根据穿膜肽的构效关系设计的TAT 的改构体,实验已经证明T1能够携带GFP在体内 有效穿过小鼠的

30、血-脑脊液屏障。本研究进一步 观察了融合蛋白His-Tl-GFP在细胞水平上的跨膜 递送作用，实验结果表明，HisTlGFP具有跨膜递 送进入CNE2及NRK52E细胞的生物活性,并且主 要定位于细胞浆和细胞核，证明穿膜肽T1对不同种 属(大鼠和人)不同组织(肾小管上皮和鼻烟癌)来 源的细胞均具穿透能力亠其中His-Tl-GFP穿透不 同细胞的细胞膜时效率存在差异，原因可能是： 不同种类的细胞，细胞的某些特性有所不同，如细胞 膜通透性或细胞膜结构不同，导致His-Tl-GFP更容 易进入某些细胞;也可能由于部分细胞的细胞连 接不够紧密,贴壁性能差,基膜结构不紧密,使细胞 表面有更多的蛋白作用位

31、点;也可能由于部分细 胞内某种蛋白酶活力降低所致。陪膜动力学研究表明,His-Tl -GFP的跨膜递送 效率在一定范围内与时间和蛋白浓度存在正相关关 系，即HisTlGFP在一定的范围内穿膜进入细胞的 量随着时间的延长或浓度的升高而增多；温度对 His-Tl-GFP的跨膜递送能力影响很小。通常，蛋白 及肽进入细胞的机制是:蛋白或肽与细胞膜上相应 受体结合，然后发生一系列构象变化,最终在细胞质 膜上形成运输孔道;或它们通过胞吞作用，进入内吞 小体后引起pH值从屮性到酸性的转化，使内吞体 质膜产生孔道，从而进入细胞浆，但以此种方式实 现的细胞内在化仅对某些分子适用，且往往受环境 温度的影响，如4T

32、时，该过程会被完全阻断。然 而,His-Tl -GFP在4%时可被活细胞摄取，提示其摄 取机制包括非经典的内吞作用。同时在41环 境中,ATP酶近乎无活性，而CPP T1介导的跨膜过 程仍有效进行，提示CPPT1进入细胞的过程可能是 通过非受体蛋白依赖的方式实现的。His-Tl -GFP对细胞的毒性作用结果显示，终浓 度高达 5 gL"的 His-Tl-GFP 对 CNE2 及 NRK52E 2种细胞膜几乎没有破坏作用，即T1跨膜的过程不 损伤细胞膜，不会造成细胞质的泄漏，同时,终浓度 高达 5 g L"的 His-Tl-GFP 与 CNE2 及 NRK52E 2 种细胞孵

33、育24 h后，对2种细胞的增殖能力基本没 有影响，表明了 T1穿膜的过程不对细胞产生致死的 毒性作用。这一结果也从另一个侧面说明高浓度 (5 g-L-*)的HisTlGFP在跨膜递送的过程中对细 胞膜没有产生损伤，对细胞无毒性作用=综上所述,His-Tl-GFP是一种跨膜效率高且低 毒的新的穿膜肽融合蛋白。4参考文献：1 Wagstuff KM 9 Jans DA. Protein transduction: cell penetrating peptides and their therapeutic applications J . Curr Med Chem, 20069 13(12):

34、1371 -13872 Fawell S, Seery J, Daikh Y, Moore C, Chen LLt Pep- insky B t et al Tat-mediated delivery of heterologous proteins into cellsJ. Proc Natl Acad Sci USA9 1994, 91(2):664 - 668.3 Rudolph CPlank Ct Lausier Jt Schillinger U, Muller RH, Rosenecker J. Oligomers of the argininerich motif of the H

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36、 complexes J J. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100(4):1972-19775 Torchilin VP TAT peptide-modified liposomes for intracellular delivery of drugs and DNA J. Cell Mol Biol Lett, 2002f 7(2)：265-2676 Vivis E, Brodin P, Lebleu B. A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the

37、plasma membrane and accumulates in the cell nucleus J JBiolChem, 1997, 272(25):16010-16017.7 Wang Yt Cai ZH9 Jian LJ9 La XK. Construction9 expression and activity assay of a novel cell penetrating peptide J . Pharm 8血7?/诚(药物生物技术)， 2007, 14(2)：79-84 8 Schwarze SR, Ho At Vocero-Akbani A, Dowdy SF. In

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43、 College, Wenzhou 325035 , China; 2. Engineering Research Center of liiorceactor andPharmaceutical Deielopmeni 9 Ministry of Education 9 Changchu 130000, China)中国跖理学与#理学杂志 2008年4月；22(2)#中国跖理学与卓理学杂志 2008年4月；22(2)135 Abstract: AIM To study the transmembrane efficiency of a novel cell penetrating pepti

44、de (CPP ) fusion protein, His-Tl -green fluorescence protein ( GFP) , and its effect on cell survival. METHODS His-Tl-GFP 500 mg- L'1 was incubated witli CNE2 and NRK52E cells separately for 6 h. And its cell penetrating efficiency to CNE2 and NRK52E cells was ob- served by fluorescence microsco

45、py. For its transmembrane dynamics analysis, His-Tl -GFP 500 mg L 1 was incubated with CNE2 and NRK52E cells separately from 10 min to 24 h to investigate the influence of incubation time； His-Tl-GFP 25 mg'L-1 -1.0 g'L-1 was incu bated with CNE2 and NRK52E cells for 6 h to detect the effect

46、of incubation protein concentration ；His-Tl-GFP 500 mg L_ 1 was incubated with CNE2 and NRK52E cells at 4% and 37% for 6 h to analyze the effect of incubation temperature All the dynamic data were calc lated with fluorescence intensity inMiiunoanalyz- er. Finally, the toxicity of His-Tl-GFP 5.0 g L

47、_l on CNE2 and NRK52E cells was evaluated with lactate dehydrogenase ( LDH) kit and MTT assay RESULTS His-Tl -GFP could effectively penetrate through CNE2 and NRK52E cell membranes, with a higher efficacy compared with its positive control His-TAT- GFP when penetrating NRK52E cell. His-Tl- GFP could

48、 penetrate into target cells in 10 min, and could increase its concentration in cells within 6 h ； also, the concentration of the protein in cells was relevant to its protein concentration :in the concentration of 25 mg L "1 to 1 0 g L"1, the concentration of the protein in cells could be increased with higher incubation concentration; and the permeation capability of His-Tl -GFP could be maintained even at 4T. When its final concentration was up to 5 0 g L"1,