高速逆流色谱分离制备蒲公英中的黄酮苷

1、高速逆流色谱分离制备蒲公英中的黄酮苷施树云1,张宇平1,赵昱2,黄可龙1,刘素琴1(1.中南大学化学化工学院长沙410083;2.浙江大学药学院杭州310058 摘要:目的:采用高速逆流色谱(nsccC分离纯化蒲公英中的芫花素_4一0一BD一芦丁糖苷和橙皮苷。方法:采用C.。反 相色谱对蒲公英的正丁醇部位进行预处理,再利用正丁醇一正己烷一水(体积比为1:1:2为溶剂系统对其进行分离,上相为 固定相,下相为流动相,流速为1.5mL/min,检测波长为254llln。所得产品经过高效液相色谱进行检测,通过面积归一化法 检测纯度。经过紫外,质谱,一维以及二维核磁共振等方法进行结构分析鉴定。结果:经过

2、一步HSCCC可以从600mg富集 物中分离纯化得到84.6rag芫花素.4一OBD一芦丁糖苷和45.1rag橙皮苷,纯度分别为98.8%和98.1%。结论:化合物芫花 素-4一OBD一芦丁糖苷和橙皮苷均为首次从蒲公英属植物中分离得到。利用该技术,可以对中草药中的活性成分进行快速 的分离纯化以及进行相应的结构鉴定。关键词:高速逆流色谱;蒲公英;黄酮苷;核磁共振Preparative isolation and purification of two flavonoid glycosidesfrom Taraxacum golicum by hi g h -s p e e d i r o 1ar

3、axaca mongoilcum Dy 11il巨h-scounter-current chromatographySHI Shuyunl,ZHANG Yu-pin91,ZHAO Yu2,HUANG Ke-lon91,LIU Suqinl('School of Chemistry and Chemical Engineering,Central South University,Changsha 410083,China;2Institute of Materia Medica,College of Pharmaceutical Sciences,Zhejiang University

4、,Hangzhou 310031,China ABSTRACT:OBJEC。In噬:Two flavonoid glycosides,genkwanin-4LO-B-D-lutinoside and hesperidin were isolated and purified from the aerial part of Taraxacum mongolicum,a traditional Chinese medicineffCMby high-speed counter-current chromatography (HSCCC.蛐咖ODS:AfterC,s open colurmi chr

5、omatography served as enrichment step,high-speed counter-current chromatography (HSCCCwasused for the final purification.The target compounds were finally isolated and purified with a solvent system composed of n-hexane-n-butanol-water(h l:2,v/v/v.The HSCCC fractions were analyzed by high-performanc

6、e liquid chromatography(HPLCand the chemical structures of the two flavonoid glycosides were identified by UV,ESIMs,1H NMR,”C NMR and HMBC analysis. I也SULl晦:In a single operation,600mgof the enriched extracts of T.mongolicum Was separated to yield 84.6mg of genkwanin-4-O-BDlutinosideand 45.1mg of he

7、speridin with the purity of 98.8%and 98.1%,respectively.CONCLUSION:Genkwanin-4-O-B -D-lutinoside and hesperidin were obtained from the plant of genus Taraxacum for the first time.which may be used for in vitro and in vivo studies and reference substances for analytical purpose.This technique should

8、also be applicable to the preparation of unknown bioactive compounds from traditional Chinesemedicine(TCM. KEY WORDS:High-speed counter-current chromatography;Taraxacum mongolicum;Flavonoid glycoside;NMR蒲公英Taraxaeum mongolicum Hand.一Mazz.,又名蒲公草、黄花地丁等,为菊科多年生草本植物。原产 欧洲和北亚,在我国除东南华南省区外,几乎遍及全国。蒲公英是一种易得且集

9、营养与药用于一身的宝贵 野生资源。它不但可做成美味可口的菜肴,还具清热解毒、消肿散结、利胆利尿等功效。现代药理研究表 明,其具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤和抗炎等多种作用”。31。在传统中医药里,蒲公英还和其它传统中药一 起使用,治疗肝炎,支气管炎,肺炎,乳腺炎等疾病邮1。但是到目前为止,对于蒲公英的药理活性局限于 经验值嗍,且仅限于蒲公英的粗制剂,缺乏单一化学成分的研究;有关蒲公英的化学成分研究报道的较少 17-10。因此,进一步研究蒲公英的化学成分,对阐明其药效物质基础具有重要意义。 221实验中通过预试验确定黄酮类化合物为蒲公英的主要次生代谢产物。目前报道分离黄酮类化合物的方 法主要有硅胶柱层

10、析,大孔吸附树脂柱层析,聚酰胺柱层析以及制备液相色谱法,但是这些方法存在操作 成本高,制备量有限等问题,因此研究开发黄酮类化合物的高效分离纯化方法成为当前研究的关键。高速 逆流色谱蛳gh speed counter current chromatography,HSCCC是20世纪80年代初期发展起来的一种无需使 用任何固态支持介质的液液分配色谱技术。其基本原理是根据被分离的物质在两相溶剂系统中的分配系数 不同而得到最终分离。这种分离技术由于不使用固体支持介质,避免了因与固体填料发生不可逆吸附而造 成的样品损失、失活变性等常规填料易产生的弊端,可使样品得以全部回收,具有分离容量大、性能强、 高

11、效、快速的特点,尤其适用于制备性分离u1。121。逆流色谱已广泛应用于天然产物中有效成分的分离u¨71。 本文采用常压反相柱层析与HSCCC相结合的方法,成功的从蒲公英的正丁醇部位分离制备了两个高 纯度的黄酮苷类化合物:芫花素-4一OB-D-芦丁糖苷和橙皮苷(图1。通过HPLC对样品的纯度进行了测 定,并经过紫外,质谱,一维以及二维核磁共振等方法进行结构鉴定。 H H3CoH ogenkwanin-4一Op-Dlutinoside(C2BH32014HUH Uhesperidin(C船H34015图1芫花素4-一O-B衅丁糖苷和橙皮苷的结构 Fig.1. C,hemieal slru

12、chlrca 0f鲫k啪nin4LOL B-D-lufnoside衄d hesperidin.1实验部分1.1仪器 n高速逆流色谱仪系统:多层螺旋管高速逆流色谱仪,由浙江工商大学食品与生物工程研究所杜琪珍教 授研制。聚四氟乙烯管(PTFE分离柱,内径1.6In/n,总容量420mL;进样环体积20mL;并配有FMI恒流 泵(浙江仪器厂,杭州、PC300可变波长紫外检测器和SCJS一3000工作站(天津科器仪器厂,天津。高效液相色谱系统:Waters Alliance 2695高效液相色谱仪(美国Waters,包括四元泵,脱气机,自动进 样器,柱温箱,2696二极管阵列检测器和Empower p

13、m操作系统。1.2材料与试剂 .蒲公英全草于2004年1月购自安徽,由浙江大学药学院陈柳蓉教授鉴定。实验中使用的正丁醇,正 己烷,甲醇,乙醇,乙酸乙酯、石油醚等试剂均为分析纯,购自杭卅海洋二所。用于HPLC分析的甲醇为 色谱纯,购自Merck公司。水为自制双重蒸馏水,并经0.45pm的微孔滤膜过滤。1.3黄酮苷的提取和富集取适量药材粉碎,用95%的乙醇回流提取三次,过滤,合并后浓缩。浓缩液用水混悬,并用石油醚、 乙酸乙酯和正丁醇依次萃取。将正丁醇萃取部位过装有c。的常压柱子,依次用水、30%甲醇和50%甲醇 洗脱。将50%甲醇洗脱部位浓缩至干即为样品。将样品至冰箱保存、备用。1.4两相溶剂系统

14、以及样品溶液的制备HSCCC溶剂体系为正丁醇一正己烷一水(体积比为1:1:2,按比例配制于分液漏斗中并剧烈振荡,体 系分相平衡后分离出上下相,分别超声脱气30min备用。实验中精确称取600nag,加入20mL流动相,振荡使之溶解,进行高速逆流色谱分离制备。1.5高速逆流色谱分离过程首先将固定相泵入高速逆流色谱仪的螺旋管,待螺旋管完全充满后,开启速度控制器,使高速逆流色 谱仪按顺时针方向以800r/min旋转,同时以1.5mldmin的流速泵人流动相。当体系达到流体动力学平衡后, 将样品由进样阀注入分离管路。柱后流出物以紫外检测器检测,检测波长为254RITI。根据色谱图收集色谱 峰组分,浓缩

15、再冷冻干燥样品。1.6高效液相色谱分离条件色谱柱:Waters SymmetryRPl8(3.9×250ln/n,5肛面;流动相为:甲醇一0.1%的HAc溶液=60:40 (v/v,流速为0.8mL/min,进样体积10.0“L,检测波长为254Rill,柱温30o c。实验中采用HPLC来测 定样品的纯度(面积归一化。1.7质谱和核磁共振分析ESIMS在Apex III质谱仪上进行测定;核磁共振仪为Varian INOVA-400超导核磁共振仪,氘代试剂 为DMSOd6。2结果与讨论2.1HPLC条件优化。研究了不同体系以及不同比例的流动相对蒲公英中黄酮富集部位的HPLC行为的影响

16、。结果表明:当 采用甲醇-0.I%HAc(60:40,v/v等度洗脱,流动相流速为0.8mL/min,柱温为30o C时,可取得良好的分 离效果。在此条件下,蒲公英黄酮富集部位的色谱图见图2一A,峰1和2分别为芫花素一4一OpD一芦丁 糖苷和橙皮苷。百 甍。 哥菖文。哥图2I删Lc和Inr图A一黄酮粗提物;B一逆流色谱流分I;c一逆流色谱流分Il; 1一芫花素_4一O一13一D一芦丁糖苷;2-橙皮苷Fig.2.(AHPLC chromatogram of enriched extracts of Taraxacum mongolicum,(B-CHPLC analyses and UV spe

17、ctrum of the p嘣fied compounds by HSCCC.Peaks 1and 2correspond to genkwanin-4一O一13一Dlutinoside and hesperidin.respectively.2.2HSCCC分离条件的优化应用HSCCC分离纯化天然产物中活性成分的关键是选择合适的两相溶剂系统。实验中,根据所分离 的化合物的特性,考察了化合物在不同比例的正己烷一正丁醇一水体系中的分配系数。实验结果表明,芫花 素一4一OBD一芦丁糖苷和橙皮苷在正己烷一正丁醇一水(4:4:8,v,、,/v中的分配系数分别为0.64和1.39(表1。 而且将上述体系

18、用于HSCCC分离时,固定相保留适中,因此该系统被用来分离目标成分。表1目标化合物在不同体积比的正己烷一正丁醇一水体系中的分配系数Table 1partition coeftlcientsof the target components indifferent ratio of volume in n-hexane-n-butanol-water solvent system.对流动相流速以及转速也进行了优化,结果发现,在流速为1.5mL/min,转速为800r/min时,分离结 果较好。在此分离条件下,固定相保留值为56%,分离时间小于6h,HSCCC色谱图见图3。从600mg粗 提物中可一

19、次性分离得到84.6mg芫花素_4一OBD一芦丁糖苷(峰I,接收时间145200min和45.1mg橙 皮苷(峰II,接收时间240280min。对所接收流分进行TLC分析,均为单一斑点。用HPLC进行分析时, 峰I和II均为单一峰,纯度分别为98.8%和99.1%(图2Bc。冒蕊、-一,名Timemm图3蒲公英中黄酮富集部位的高速逆流色谱图Fig.3.Preparative HSCCC separation of the enriched extracts from T.mongolicum after cleaning up by CI,resin.Fractions I and IIco

20、rrespond to genkwanin-4-O-13-D-lutinoside and hesperidin,respectively. .2.3产物结构鉴定根据ESIMS,1HNMR、13CNMR和HMBC对产物进行了结构鉴定。I犟I:ESIMS(m,z:593【M+H】十;。H-NMR(DMSOd6,400MHz812.89(1H,br s,5-OH,8.04(2H,dd,J =9。0,2.0Hz,H-6and H一2,7.15(2H,dd,J=9.0,2.0Hz,H一3and H一5,6.92(1H,s,H一3,6.80(1H,d,J=2.0 Hz,H-8,6.47(1H,d,J=2

21、.0Hz,H一6,5.07(1H,d,J=7.2Hz,H一1”,4.58(1H,br s,H一1,3.88(3H,s, 7-OCH3,3.203.60(6H,m,H-2”to H一6”,3.203.60(3H,111,H一2to H一6,2.51(1H,d,J=6.0Hz,H一5, 1.10(3H,d,J=6.0Hz,H-6;”C-NMR(DMSOd6,100Mnz8182.3(s,C-4,164.2(s,C一7,163.2(s,C一2, 162.7(s,C一9,161.4(s,C-5,157.2(S,C一,128.7(d,C一2and C-6,123.0(s,C-1,115.0(d,C-5a

22、nd C-3。, 105.7(s,C-10,104.1(d,C-3,100.8(d,Cl”,100.2(d,C一1,99.9(d,C一6,95.1(d,C一8,76.5(d,C一5”,75.9 (d,C-3”,73.4(d,C4,72.3(d,C-2”,71.0(d,C-4”,70.6(d,C-3,69.9(d,C一2,68.6(d,C-5,66.4(t, C一6”,55.9(q,7-OCH,18.1(q,C一6。通过与文献对照“引,峰I被鉴定为芫花素_4一OpD一芦丁糖苷。 峰II:ESI-MS(m/z:609M+H】+;1HNMR(DMSO-&,400MHz812.0l(1H,br

23、 s,5-0H,6.97(1H,d,J= 2.0Hz,H一2,6.88(1H,d,J=8.0Hz,H-5,6.83(1H,dd,J=8.0,2.0Hz,H一6,6.14(1H,d,J=2.0Hz,H一8, 6.13(1H,d,J=2.0Hz,H-6,5.50(1H,dd,J=11.0,5.0Hz,H一2,4.97(1H,d,J=7.2Hz,Hl”,4.54(1H,br s, H-1,3.78(3H,s,4-0CH3,3.20-3.60(6H,in,H一2”to H一6”,3.20一3.60(3H,m,H一2to H-6,3.11(1H,dd,224J=17.0,11.0Hz,H一3a,2.78

24、(1H,dd,J=17.0,5.0Hz,H一3b,2.51(1H,d,J=6.0Hz,H-5,1.09(3H,d,J=6.0Hz,H一6;”CNMR(DMSOd6,100MHz8197.2(s,C-4,165.5(s,C一7,163.2(s,C-5,162.7(s,C一9,148.1(s,C4,146.6s,C一3,131.1(s,C一1,118.1(s,C6,114.3(d,C一2,112.2(d,C-5,103.5(s,C-10,100.8(d, C一1,99.6(d,C-1”,96.5(d,c一6,95.7(d,C一8,78.6(d,C一2,76.5(d,C-5”,75.7(d,C-3”

25、,73.2(d,C4-”, 72.2(d,C-2”,70.9(d,C4.,70.5(d,C-3,69.7(d,C一2,68.5(d,C-5,66.2(t,C-6”,55.8(q,4一OCH3, 42.2(t,C一3,18.1(q,C一6。以上数据与文献【19】一致,确定为橙皮苷。3结论以上实验结果表明,HSCCC能有效的从蒲公英中分离出黄酮苷类化合物,且得到的高纯度产品可以作 为标准品用于分析测试中或者进行相关的药理活性研究,该方法具有高效性和独特性。两个单体化合物芜 花素一4。一OBD一芦丁糖苷和橙皮苷均为首次从蒲公英属植物中分离得到。REFERENCES【1】ZHU M,WONGP Y,L

26、I RC.Effects of Taraxacum mongolicum on the bioavailability and disposition of ciprofloxacin in rats【J】.J Pharm Sei,1999,88(6:632-634. 【2】 SCHLITZ k CARLE R,SCHIEBER A.TaraxacumA l七view Oil its phytochemical and pharmacological profileJ1.JEthnopharmaeol,2006,107(3:313-323.31Chinese National Pharmaco

27、poeia Committee,Chinese Pharmacopoeia(中华人民共和国药典【M】.Beijing:Chemical Industry Press,2000,P.289. 【15】 【161【17】18】 【191LEU Y L'WANG Y L HUANG S C,SHI L S.Chemical constituents from roots of Taraxacum formosanum【J】.Chem Pharm BuU,2005,53(7:853-855.SWEENEY B,VORA M,ULBRICHT C,BASCH E.Evidencebased sy

28、stematic review of dandelion ffaraxacum officinalebynatural standard research collaborationJ1.J Herb Pharmacother,2005,5(1:79-93.GURIBFAKIM A.Medicinal plants:Traditions ofyesterday and drugs oftomorrowJ】.Mol Aspect Med,2006,27(1:1-93.LING Y,BAO Y Y,ZHU L L,ZHENG J H,CAI S Q,XIAO Y,Chemical constitu

29、ents of Taraxacum mongolicumJ1.Chin Pharm J (中国药学杂志,1997,32(1o:584586. LING Y,BAO Y Y,ZHANG Y L'CAI S Q,ZHENG J H.Chemical constituents of Taraxacum mongolicum【J】.J Nav Gene Hosp PLA(海军总医院学报,1998,l 1,167169. UNG Y,BAO Y Y,GUO X F,XU Y,CAI S Q,zHENG J H.Isolation and identification of two flavono

30、ids from TaraxacummongolicumJ】.Chin J Chin Mater Med(中国中药杂志,1999,24(4:225226.YAO W,LIN W Y,ZHOU C X,ZHAO Y.Studies on constitutes from Taraxacum mongolicum叨.Chin J Chin Mater Med(中国中药杂志'2007,32(10:92“930.ITO Y.Efficient preparative counter-current chromatography with a coil planet centrifuge【J】.

31、J Chromatogr,1981,214(1:122-125. ITO Y.Recent advances in counter-current chromatographyJ1.J Chromatogr,1991,538(1:3-25. UU Z L,WANG J,SHEN P N,WANG C Y,SHEN Y J.Microwave-assisted extraetion and highspeed counter-current chromatography purification offertdic acid from Radix Angelicae sinensisJ1.Sep

32、 PurifTechnol,2006,52(1:1821.PENG J Y,JIANG Y Y,FAN G R,CHEN B,ZHANG Q Y,CHAI Y F,WU Y T.Optimization suitable conditions for preparative isolation andseparation of curculigoside and curculigoside B from Curculigo orchioides by high-speed counter-current chromatography fJ】.Sep Purif Technol,2006,52(1:22-28.LIU Z L,JIN Y