TGF-β和BDNF联合诱导成年大鼠BMSC向神经样细胞分化的研究

1、TGF-和BDNF联合诱导成年大鼠BMSC向神经样细胞分化的研究         11-03-30 15:04:00     编辑：studa20               作者：梅晰凡，吕刚，王岩松，李全双，郭占鹏【摘要】  目的 探讨转化因子(TGF-)和脑源性神经生长因子(BDNF)联合诱导成年大鼠骨髓基质细胞成神经细胞

2、的可能性，为神经再生及脊髓损伤的治疗提供一种新方法。方法 从大鼠骨髓中分离培养骨髓基质细胞并传至第5代，诱导前2 h先用含1 g/L转化因子（TGF-）及20%FBS的DMEM培养液培养，以促进细胞分裂，然后用脑源性神经生长因子(BDNF)作诱导剂，观察细胞形态的变化，并采用免疫组织化学法检测诱导后的细胞表达NF，NSE，GFAP等特异性标志物。结果 诱导后5 h，部分细胞的形态已发生改变，12 h后大部分细胞不仅在形态上表现为神经元样特征，而目NF及NSE等特异性抗体呈阳性表达，而GFAP抗体表达呈阴性。结论 转化因子(TGF-)和脑源性神经生长因子(BDNF)能将骨髓基质细胞诱导成神经元样

3、细胞。 【关键词】  骨髓基质细胞；转化因子；脑源性神经生长因子；细胞分化；神经元样细胞    Abstract：Objective  To study the possibility that transforming growth factor- and brain-derived neurotrophic factor induces adult rat bone marrow stromal cells(BMSCs) into neurons, and provide a new method for neuron regenerati

4、on and the treatment of spine cord injury. Methods  The bone marrow stromal cells from adult rats were isolated and cultured for 5 passages. The BMSCs were incubated with DMEM containing 20% FRS and TGF-(1g/L )for 2 hours. Then the media were replaced by DMEM media consisting of BDNF(50g/mL). T

5、he morphological changes of the cells were observed under phase contrast microscope，the cells were stained immunocytochemically with NF，NSE and GFAP antibodies respectively. Results  After 5 hour of induction with neurotrophic factor, some cells showed morphological changes, and 12 hours later,

6、many BMSCs became neuron-like cells and were stained positively with NF，NSE antibody，but negatively with GFAP.Conclusions  The bone marrow stromal cells can differentiate into neuronlike cells by the induction of transforming growth factor-and brain-derived neurotrophic factor.   

7、; Key words：bone marrow stromal cells；transforming growth factor-；brain-derived neurotrophic factor；cell differentiation induction；neuron-like cells    近年来的基础研究发现脊髓损伤后采用组织工程方法，将有活性的种子细胞移植治疗脊髓损伤，能促使损伤轴突修复、再生和恢复脊髓部分神经功能，骨髓基质细胞（MSC）可为基因治疗神经系统的疾病提供良好的载体1。骨髓基质细胞诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞及神经细胞的研究也见报道，为

8、了探讨转化因子和脑源性神经营养因子对骨髓基质细胞向神经细胞联合诱导分化的可能性和条件，为以后神经细胞再生和脊髓内移植的研究奠定基础23，本研究观察了转化因子（transforming growth factor-，TGF-）和脑源性神经营养因子( brain-derived neurotrophic factor, BDNF)对成年大鼠骨髓基质细胞的诱导分化作用，现报告如下。    1  材料与方法    1.1  主要试剂和仪器    TGF-和BDNF购自Sigma公司，小鼠抗特异

9、性神经元烯醇化酶( NSE)单抗，小鼠抗神经丝蛋白(NF)单抗，小鼠抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP)单抗购自华美公司, FITC标记羊抗小鼠IgG购自 Gibco公司，SABC试剂盒购自武汉博士德公司。主要仪器：Olympus CK40倒置显微镜，Olympus BX51荧光显微镜。SD大鼠由锦州医学院实验动物中心提供。    1.2  骨髓基质细胞的分离及培养    梅晰凡，等：TGF-和BDNF联合诱导成年大鼠BMSC向神经样细胞分化的研究辽宁医学院学报  2008年10月，29(5)SD大鼠雌雄不限，130 g

10、左右，将其拉颈处死，75%酒精浸泡10 min，无菌条件下取出股骨，除去骨周围的肌肉组织，剪开骨两端，显露骨髓腔，用10 mL注射器，以IMDM培养液从一端冲洗骨髓腔，将骨髓冲到平皿中，用吸管反复吹打含有骨髓的冲洗液使其成为单细胞悬液，后用150目尼龙网过滤，滤液常温下1000 rpm离心10 min，弃上清，沉淀内加入红细胞裂解液(每只鼠骨髓内加入1 mL)置常温下2 min，后加入IMDM培养液10 mL，吹散后1000 rpm离心10 min，弃上清后向沉淀内加入IMDM含10%FBS培养液10 mL，吹散后计数，将细胞稀释后按8 000个细胞cm2接种于25 cm2培养瓶，于37 5C

11、O2及饱和湿度下培养，相差显微镜下观察细胞生长状况，分别于培养的第4、10、17天半量更换培养液，去除未贴壁细胞4，第20 天以0.25胰蛋白酶消化传代得到骨髓基质细胞接种于培养皿中，培养皿内置经多聚赖氨酸（Poly-L-Lysine）防脱片处理的盖玻片。    1.3  转化因子和脑源性神经营养因子联合诱导鼠骨髓基质细胞    上述细胞传代至第5代后继续培养，加入含1 g/L转化因子（TGF-）预诱导2 h，然后用含50 g/mL脑源性神经生长因子（BDNF）的IMDM念20%FBS培养基地37 5%CO2及包和湿度下培养

12、骨髓基质细胞对其进行分化诱导；以单纯IMDM含20%FBS培养基同等条件培养作对照1；并以含1 g/L TGF-的IMDM含20%FBS培养基同等条件培养作对照2；并以含50 g/mL BDNF的IMDM含20%FBS培养基同等条件培养作对照3。相差显微镜下观察细胞形态变化，培养3天后，吸弃培养液，0.01 M PBS冲洗3次，4 丙酮固定-70 保存备免疫细胞化学染色。    1.4  转化细胞的鉴定和转化率的测定    吸弃培养皿内的培养液；纯丙酮室温固定2030 min，蒸馏水洗，干燥后可冰冻保存；冰冻切片从冰箱内取出

13、，恢复至室温，PBS冲洗3 次；纯甲醇加H2O2至0.5%，室温浸泡30 min，以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗3 次；滴加正常山羊血清封闭液，室温20 min，甩去多余液体，不洗；滴加适当稀释的一抗（小鼠IgG），其中小鼠抗大鼠NSE(-)抗体稀释度为1100，小鼠抗大鼠NF抗体稀释度为1200，对照实验以0.01 M PBS液代替抗体，37 3060 min或20 60120 min，也可4 过夜；0.01 M PBS洗2 min×3次。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，2037 20 min。0.01 M PBS洗2 min×3次。滴加试剂SABC，203720 min

14、。0.01 M PBS洗5 min×4次，DAB显色：使用DAB显色试剂盒（ED1022），取1 mL蒸馏水，加试剂盒中A，B，C试剂各1滴，混匀后加至切片，室温显色，镜下控制反应时间，一般在530 min之间，蒸馏水洗涤，苏木素轻度复染，逐级脱水，透明，封片。光镜下观察，随机选取5个视野，每个视野计数200个细胞，计算阳性细胞数目。    2  结    果    2.1  大鼠骨髓基质细胞生长情况    刚接种时细胞种类较多，包括造血干细胞及分化程度不同的其它各系血细胞、骨髓基质细胞等，散在悬浮于培养液内。培养12天后，骨髓基质细胞开始贴壁，经过数次换液后，未贴壁的细胞逐步被清除，培养10 天时，细胞以造血干细胞和骨髓基质细胞等贴壁生长的细胞为主5；培养20 天后，大多数造血干细胞死亡，剩下的主要是骨髓基质细胞。典型的骨髓基质细胞的形态特点是：型细胞较少，梭形，70 m×8 m大小，胞核20 m×5 m大小；型细胞为主要类型，形态差异较大，胞体大而扁平，3050 m大小，有突起，胞核圆形，直径1520 m，立体感不强，胞浆淡染。同时，混有少量造血干细胞。