EM菌分类组成及培养技术

1、EM1分类组成及培养技术一.EM菌分类组成d辰关宜1.1口仆是1.1分离培养基：1.1.1肉 膏 蛋 白 陈 培 养 基 （ 培 养 细 菌 ） 牛 肉 膏3g/L,蛋 白 陈10g/L,氯 化 钠5g/L,琼 脂15-20g/L,pH7.2-7.4,1.1.2改良PDAte养基或麦芽汁培养基（酵母菌）20%马铃薯汁1L葡萄糖20g/LKHPO3.0g/LMgS0.5g/LVB18mg半片）琼脂15-20g/L自然pH1.1.3乳酸菌培养基（培养乳酸菌）1.1.3.1番茄汁培养基：牛肉膏10g/L,蛋白陈10g/L,酵母膏10g/L,葡萄糖10g/L,番茄汁200g/L,吐温-800.05%,

2、碳酸钙15-20g/L,澳甲酚绿0.01%,琼脂15-20g/L,番茄汁的制作：将新鲜番茄洗净，切碎（切勿捣碎），放入三角烧瓶，置4c冰箱8-12h,取出后用纱布过滤即成。如一次使用不完，可将其置入0c冰箱，可保存四个月。使用时让其在常温下自然溶解。pH6.51.1.3.2MRS培养基（分离培养计数用）蛋白陈10g/L牛肉膏10g/L酵母膏5g/L柠檬酸氢二钱2g/L葡萄糖20g/L吐温801.0mL/L、乙酸钠5g/L磷酸氢二钾2g/L硫酸镁0.58g/L硫酸钮0.25g/L琼脂15g/LpH6.5。（分离培养基），当MRS基冷却至45-50C时,加入已灭菌的碳酸钙充分混匀，倒平板。1.1.

3、4光合细菌培养基（培养光合细菌）3.2酵母膏1.0g/L羟基丁二酸（苹果酸）0.5g/LNH4C11.0g/LNaAC3.0g/LNaC11.0g/LNaHCO31.5g/LK2HPO40.2g/LMgSO40.2g/LPH7.0-7.2（富集用）4.2.酵母膏3.0g/L,蛋白陈3.0g/L氯化钙0.3g/L,硫酸镁0.5g/L,琼脂8g/L,生长因子5mL/L,pH6.8-7.0生长因子：维生素B10.001mg,尼克丁酸0.1mg,对氨基苯甲酸0.1mg,生物素0.001mg,以上药品溶于蒸储水中，定容至10mL,然后过滤除菌。4.2.2RCVBN孝母膏0.1g/L蛋白陈0.01g/LN

4、aAC2.0g/L丙酸钠0.3g/LNaC10.5g/LNH4C11.0g/LMgSO0.2g/L谷氨酸0.2mgK2HPO40.3g/LKH2PQ0.5g/LCaC120.05g/LMnC20.003g/LFeSO40.005g/L（选择分离培养基）PH6.8-7.0马丁培养基（培养丝状菌）葡萄糖10g/L,蛋白陈5g/L,三水合磷酸二氢钾1g/L,水合硫酸镁0.5g/L,孟加拉红（1mg/mL3.3mL,琼脂15-20gpH自然，加入2温氧胆酸钠溶液20mL链霉素溶液10000u/mL0.33mL或用虎红培养基,涂平板或划线时琼脂增加5g/L。高氏合成一号培养基（培养放线菌）可溶性淀粉20

5、g/L,硝酸钾1g/L,三水合磷酸氢二钾0.5g/L,氯化钠0.5g/L,七水合硫酸镁0.2g/L,七水合硫酸亚铁0.01g/L,琼脂15-20g/L,抑制剂重铭酸钾50-70mg/L即重铭酸钾3%3.3mL/L,100ml培养基加入1ml0.1%的FeSO溶液。（分离计数保存用）pH7.2-7.4黄豆粉25g/L牛肉膏5g/L葡萄糖15g/L碳酸钙1.0g/L磷酸氢二钾0.5g/L硫酸镁0.5g/L海盐10-15g/L（种子培养基）pH6.8-7.0乙醇培养基（培养乙酸菌）乙醇20mLL,乙酸钠5g/L,酵母膏1g/L,磷酸氢二钾0.4g/L,硫酸钱0.5g/L,硫酸镁0.2g/L,碳酸钙1

6、0-15g/L,琼月旨15-20g/LpH7.0发酵培养基：1.2.1葡萄糖10g/L酵母膏10g/L蛋白陈6g/LNaC110g/LMgSO40.2g/LKHPO0.5g/L&HPO0.3g/LPH6.5一6.81.2.2葡萄糖10g/L可溶性淀粉5g/LK2HPO1g/LMgSO40.5g/LKNO31g/LFeSO0.01g/LCaC120.01g/LPH6.5-6.81.2.3糖蜜5-10%酵母提取物0.3%尿素0.3-0.4%K2HPO0.1-0.2%海盐0.3-0.5%VC0.01-0.03%PH自然糖蜜5-8%酵母提取液2%豆芽汁5%西红柿汁3-5%PH7.0葡萄糖15-

7、25g/L尿素0.4-0.8%玉米浆15-25g/L蛋白陈15-25g/L酵母膏15-25g/LMnSO40.02-0.05g/LvBvc1.0g/LPH6.8-7.02.菌种分离纯化培养：样品来源：EM6利菌多菌种分离：将试样菌液稀释至10-2,采取稀释平板法进行分离。稀释平板法操作要求：方法1:取无菌平板3-5个倒平板（培养基温度不宜过高过低）,空培12-24h,用无菌吸管吸取约0.1ml10-2稀释菌液于平板1涂布，其他平板分别0.1ml无菌水，依次涂布，经培养后各平板出现不同数量的单菌落。方法2:取3-5个空平板，平板1加入10-2稀释菌液约1ml,其余平板加1ml无菌水或生理盐水，然

8、后用无菌接种环从平板1蘸取两环依次涂抹几次，立即倒入45-50C培养基混均后倒置培养。细菌总数、醋酸菌、酵母菌和放线菌采用方法1,乳酸菌和光合细菌（暂时不做）方法1双琼脂平板法，丝状真菌方法2（减少菌落扩散）。菌落挑选：选择涂布或混菌平板上的30-50个单菌落的进行识别，太少会容易漏选，太多不易识别或相互接连。种纯化：采用划线分离法菌株进行纯化培养1-3次，至纯培养物。对于分离后单菌落识别不清的，可在相同培养基上划线培养后进行菌落形态比较区别，然后接种于斜面低温保存备用。兼于微生物对培养基的选择性，乳酸菌群在番茄汁培养基和MRSW养基培养，酵母菌在PDA养基和虎红培养基培养，尽量选择多的不同单

9、菌落，然后在相同培养基上进行纯化培养后对菌落识别。菌种鉴定：生理生化鉴定（菌落特征形态特征生理生化特征）和分子学鉴定二.EMEM菌发酵工艺技术.菌种来源：乳酸菌群：EM6PJ菌多分离筛选菌株2-3株酵母菌群：上述产品纯化筛选菌株2株，热带假酵母1株（广东微生物所）芽抱杆菌群：南海所产品分离纯化菌株1株，三环肥水产品分离种1株放线菌群：弗氏链霉菌1株（广东微生物所）丝状真菌：黑曲霉1株，米曲霉1株（广东微生物所）光合细菌群：德国沼泽红假单胞菌1株，上海水大沼泽红假单胞菌1株（中国农科院资划所）.菌种的制备：工艺流程：斜面-三角瓶或茄型瓶-血清瓶-种子罐（糖蜜灭菌罐）菌种制作：菌种活化：保存时间较

10、短的斜面，可直接用于生产，甘油管、石蜡管和冻干管需活化后使用，冻干管每支接两支斜面。斜面保种试管15x150mnl18x180mm （8-9ml） ,生产斜面25x200mm （20-25ml） ,200-250ml茄型瓶 （45-50ml）。菌悬液的制备： 每支斜面分别加入5-10ml无菌水或生理盐水， 用接种环刮洗菌苔制成菌悬液备用。三角瓶或茄型瓶培养接种前灼烧管口迅速一对一加入三角瓶中，茄型瓶（45-50ml/200-250ml即体积的20%）,用无菌吸管加入2-3ml菌悬液，作水平晃动，使菌液均匀布满整个琼脂表面，使用时加入30ml无菌水进行刮洗制成菌悬液，每瓶相当于150ml液体菌种

11、。血清瓶培养：培养基、装料量及培养条件，根据菌种的生理特性确定。种子罐培养培养基以较高碳氮比配料，装料量70-80%,采用常压间歇灭菌（两次间隔24h）。制种实例：斜面菌种：酵母菌株：2-3株乳酸菌株2-3株芽抱杆菌2株放线菌1株丝状真菌2株光合细菌2株，分别制成菌悬液备用。三角瓶或茄型瓶培养芽抱杆菌、丝状真菌和放线菌采用茄型瓶培养，每株制作两瓶。乳酸菌和酵母菌液体摇瓶培养，每瓶接一支斜面不同菌种菌悬液，在适宜条件下培养。培养温度：酵母菌丝状真菌和放线菌25-28C乳酸菌和芽抱杆菌30-37C.培养时间：乳酸菌和酵母菌2-3d,丝状真菌5-7d,放线菌7-10d芽抱杆菌1-2d。注：液体培养丝

12、状真菌2-3d,放线菌（种子转接2-3d）6d,芽抱杆菌18-20h.乳酸菌液培养液使用量850ml/L三角瓶，酵母菌液体摇瓶培养350ml/L三角瓶。血清瓶培养：酵母菌培养液6.5L/10L25-28C120r/min48h,乳酸菌培养液19L/2x10L30-35C静置2-3d,芽胞杆菌培养液4.5L/10L30-35C180-200r/min18-22h,放线菌培养液4.5L/10L25-28C120-140r/min48-72h,丝状真菌培养液4.5L/10L25-28C120r/min48-72h。常压种子罐培养装料量800L/1200L种子罐（常压），常压间歇灭菌：灭菌温度100c

13、60-90min,间隔12-24h,再次灭菌（100C）60min,通冷却水降温至温度30-35C接种培养，8-10h,间歇搅拌两至三次，12h后静止培养，培养时间：室温30-35C5-7d,25-30C8-10d20C以下10-14d,PH4.0-5.0.活菌数在8-10亿cfu/ml。菌种分装：用3%双氧水对5L塑料桶冲洗灭菌后分装，菌液要满桶密闭。.EM8扩大培养：种子罐扩培：捅体灭菌（1000L）将捅体内外清洗干净， 然后注满自来水， 并加入250-300ml10%次氯酸 （钠） ， 搅拌均匀， 静止12-24h后泵入其他种子罐中，连续循环使用。捅体内外用滤菌水冲洗两遍及时使用。留种培

14、养时罐体不作清洗灭菌，培养液使用后要对罐体实施灭菌操作程序进行。培养基配制培养基：糖蜜100kg酵母膏1.25kg（0.75kg追加）尿素0.70kgKH2P040.5kg无机复合盐0.25kg0种子培养基和发酵培养基同时进行常压灭菌，95-100C2-3h0要防治出现灭菌过程中液体外溢现象。营养成分添加：糖蜜10%（100kg）、酵母提取物、尿素、磷酸二氢钾、少量矿微元素等。发酵培养基进罐后预留培养液作为种子培养液，追加酵母提取物（0.75kg）,根据培养液PH大小酌情用盐酸调节PH至5.0-5.5,菌液留加时不调整。接种量：5.5-8.0%即55-80卜9。培养条件：温度C时间d15-20

15、12-1520-308-1030-356-735-384-5注：微氧或厌氧培养。发酵罐扩培（8000L）培养基：糖蜜10%（800kg）酵母膏4.0kg尿素5.6kgKH2PO40.5kg复合盐2.0kgo3.2.2罐体灭菌消毒：生产完毕后应及时清洗消毒罐体，防止残留滋生杂菌，打开罐体底部排液阀，用滤菌水将罐体冲刷两遍，必要时带用清洗工具，并关闭排水阀，将次氯酸钠溶液适度稀释对罐内泼洒，消毒灭菌30-45min.打开罐底排液阀，用滤菌水冲洗两遍，水排完后关闭阀门。2.2.3发酵条件：温度C时间d30C-3525-3020-3030-3515-2035-45放罐指标：菌液PH3.0-4.0,活菌

16、数大于6-10 x108cfu/mL。菌液产气小，呈棕红色半透明液体。较浓酸甜味或酸味，气味纯正，酸味适中，无臭味。观察与处理：发酵二至三天液体起泡沫，七至八天泡沫消失，液面浮一片悬浮物，十三天左右悬浮物沉入底部发酵基本完成。一般培养温度高悬浮物多些。颜色由淡黄色变成半透明棕黄（红）色（菌液呈乳白色视为发酵失败）。发酵菌液气味呈酸带甜香.尝之略涩。酸味过小，系发酵时间短.营养少.温度低所致。液面少许浮物属正常，少量臭味视为培养时间短.染菌所致，应适当放气。菌种复配：光合细菌在灌装前加入，打入量为1.5-2.0%，即每罐120-160L,作为水产有效微生物的补充。附：.水质改良有效微生物（EM二

17、步连续发酵工艺（专利）在同一容器先后进行好氧和厌氧连续发酵。好氧特征是高含氧高PH和低碳源，厌氧特征是高碳源低PH和缺氧。该工艺的优点：菌种搭配平衡，乳酸菌酵母菌芽抱杆菌分别达到106cfu/mL,总活菌数达到107cfu/mL以上，产品中所有细菌处于抑制状态，保质期长达六个月以上，没有胀气现象。工艺操作：发酵容器1000-3000升塑料桶或不锈钢桶，底部布满气管，气泵供气（过滤空气）液体轻微流转，装液量80%g酵容器。发酵容器及器具采用化学灭菌法，培养基高压灭菌滤菌水补齐。发酵过程：（1T计）低浓度双糖培养基： 红糖0.2-0.4%蛋白陈0.05-0.10%KHPO0.10%MgSO0.01

18、%KC10.05%NaC10.05%维生素矿物元素氨基酸预混料10g/TPH7.2-7.5.接入1L（0.1%）芽抱杆菌酵母菌乳酸菌的混合液，在25-35C有氧条件下发酵2-3天，当培养液PH6.0-6.5,光密度（600）达到1.5,芽抱杆菌和酵母菌数量均达到106cfu/mL时进入高糖发酵。红糖0.5-0.7%糖蜜0.1-0.2%静止发酵3-5天。培养液PH3.5-4.0光密度（600）达到1.8,芽抱杆菌酵母菌乳酸菌数量均达到106cfu/mL，总活菌数达到107cfu/mL以上，即可放罐灌装，密封保存，保质期六个月。.有效微生物（EM制剂制备（专利）由光合细菌酵母菌放线菌乳酸菌芽抱杆菌等10属80多种组成，有的加入双歧菌群，用于农业还加入固氮菌群。制作过程：（1T计）红糖25-40kg搅拌均匀加入光合细菌放线菌酵母菌各5L,各类活菌数不低于108cfu/mL,搅拌发酵24-36h。加入乳酸菌芽抱杆菌双歧菌群各5L,各类活菌数不低108cfu/mL,继续搅拌发酵24-36h。总接种量3流右，搅拌时间2-3天,发酵温度25-35C。然后转入静止发酵10-15天。放罐指标：PH3.5-4.0呈棕红色半透明状液体，气味微甜带酸味。.多