红法夫酵母与环状芽孢杆菌混合培养破壁提取虾青素的研究

1、发酵工程学科的进展第四次全国发酵工程学术讨论会论文集红法夫酵母与环状芽孢杆菌混合培养破壁提取虾青素的研究蹇华丽1，朱明军2，梁世中2(1华南农业大学食品学院，广州510642；2华南理工大学生物科学与工程学院，广州 510640)摘要：环状芽孢杆菌能以红法夫酵母细胞壁为唯一碳源进行发酵产胞壁溶解酶，将红法 夫酵母与环状芽孢杆菌混合培养，可使环状芽孢杆菌在生长的同时产酶并逐渐溶解酵母细 胞壁，从而提取虾青素。通过对红法夫酵母与环状芽孢杆菌两阶段混合培养条件的优化，总 结出红法夫酵母产虾青素及酶法破壁提取的适宜工艺为t培养基初始糖浓度为309L，环状 芽孢杆菌的最佳接种时闻为红法夫酵母培养60h一

2、72h，接种量为10mLL(1010个细胞 mL)，接种后最适培养温度为，30，pH为65，总发酵时问为120h，在此条件下，红法夫酵母 虾青素产量可达到89602pgL，虾青素最终提取率可达到968。 关键词：红法夫酵母；虾青素；环状芽孢杆菌；胞壁溶解酶；提取0前言虾青素是一种具有极强抗氧化性能及抗肿瘤、增强免疫等生理功能的类胡萝卜素， 在医药、食品、饲料及化妆品等工业中具有广阔的应用前景。红法夫酵母由于它的高虾 青素含量1而被认为是最有可能实现工业化发酵生产虾青素的优良菌种。由于虾青素 是红法夫酵母的细胞内色素，它的提取必须破壁后才能进行，但其在酸性碱性条件下均 不稳定，所以化学处理方法不

3、太合适，而机械法破壁在大规模生产中应用也存在设备难 以放大等问题。采用酶法来使细胞壁水解从而使色素释放的方法由于作用条件温和以 及对环境污染小等优势而引起了国内外广泛关注2州。环状芽孢杆菌能以红法夫酵母细 胞壁为唯一碳源进行发酵产胞壁溶解酶，将其与红法夫酵母混合培养，可使其在生长的 同时产酶并逐渐溶解酵母细胞壁，在发酵结束之时，即可提取虾青素。由于红法夫酵母 产虾青素与环状芽孢杆菌产酶的条件有较大区别，可考虑采用分阶段混合培养，即先对 红法夫酵母进行纯培养，使虾青素合成，然后接种环状芽孢杆菌产酶水解酵母细胞壁。 本文采用5L全自动生物反应器对红法夫酵母与环状芽孢杆菌分阶段混合培养进行了研 究。

4、1材料与方法11菌种红法夫酵母菌株由Phaffia rhodozyma ATCC 66270经诱变驯化所得。环状芽孢 杆菌由Bacillus circulans A 1383(购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心)诱变选第四次全国发酵工程学术讨论会育所得。12培养基及培养条件·5L发酵罐(gioflo 3000，美国NBS公司)装3L培养基，培养基包含：葡萄糖209L一509L；(NH4)2SO209L；KH2PO59LMgSO。·7H20 lgL；酵母粉29L，初始pH 为50。发酵过程中设定搅拌转速与溶氧相关联，溶氧保持在40一5c，通气量保持3vvm。首先接种红法夫

5、酵母种子液30mL(采用YM培养基培养后收集种子将其重新悬浮在新鲜培养基中使其单细胞浓度为109个mL)，20分别培养Oh、24h、48h、72h、96h 后接种环状芽孢杆菌，接种量分别为10mL、20mL、30mL、40mL(采用加入03酵母细 胞壁的无碳培养基培养环状芽孢杆菌后收集菌体将其重新悬浮在新鲜无碳培养基中使 其单细胞浓度为1010个mL)，接种后温度分别调为20、25、30、35，pH分别调为50、55、60、65，接种后共同培养48h。13实验方法131胞壁溶解酶酶活力的测定 酶活采用灭菌过的红法夫酵母细胞壁悬浮液浊度的减少来定义【3。浊度减少通过下式进行计算：混浊度减少=-(

6、Abs。一Abs。)Abs。×100Abso：反应混和液初始吸光度；Abs。：反应时间t后混和液吸光度 酶活定义：在30，pH=65的条件下，反应60min，使反应混和液吸光度值减少50的 酶量定义为20个溶解活力单位(20 lyric units)。132细胞生长的测定 干重法及活菌计数法。133残糖的测定 采用3，5一二硝基水杨酸法71。134虾青素的抽提与测定 TA(总虾青素)的提取和测定：酵母采用酸热法破壁3，离心洗涤两次后加甲醇振荡提取，取上清液用于液相色谱分析。流动相为乙酸t甲醇。水=5。18：2(vvv)，流速05mlmin，柱温30，于波长480nm处检测。FEA(酶

7、破壁后可直接提取的虾青素)测定：将破壁方法改为酶破壁，破壁后的细胞悬浮液离心洗涤，加甲醇提取，测定方法同总虾青素。虾青素提取率计算公式：提取率=FEA(pgg)TA(zgg_1)×1002 结果与讨论21混合培养时环状芽孢杆菌接种时间的影响红法夫酵母培养不同时间后接种环状芽孢杆菌对虾青素的提取及胞壁溶解酶酶活 的影响如表1所示。结果表明随着接种时间的延迟，虾青素产量越来越高，但在红法夫 酵母培养96h后再接种，环状芽孢杆菌产胞壁溶解酶的酶活变得极低，同时也导致了非 常低的提取率，与此相反的是，24h后接种虾青素的提取率可达到最高。说明酵母细胞壁 在生长稳定期以前比较容易被胞壁溶解酶水

8、解，一旦达到稳定期，其细胞壁结构发生变蹇华丽等：红法夫酵母与环状芽孢杆菌混合培养破壁提取虾青素的研究425化，水解难度增大，虾青素提取也变得非常困难，实验结果与Duetch等8研究酵母原生 质体制备时所得出结论一致。因此环状芽孢杆菌在红法夫酵母培养60h一72h之间接种 比较合适，既能使虾青素得到较充分的积累，又能得到较高的酶活并获得可观的提取率。22培养基初始葡萄糖浓度的影响 葡萄糖浓度对红法夫酵母的生长及虾青素的积累非常重要，在一定范围内，糖浓度越高，酵母生物量及虾青素产量越高。但由于葡萄糖分解代谢阻遏作用的存在，若环状 芽孢杆菌接种时培养基中仍有较高的糖浓度，则不利于胞壁溶解酶的生产，从

9、而使虾青 素提取率偏低。从表2中可以看出，当初始糖浓度分别为209L、309L、409L、509L， 且在红法夫酵母培养72h后接种环状芽孢杆菌，酵母虾青素的产量是逐渐升高的，但当 糖浓度大于409L后，72h培养基中残糖浓度仍较高，影响了环状芽孢杆菌产酶，提取率 逐渐下降。综合考虑两方面因素，初始糖浓度选取309L-409L较为台适。23环状芽孢杆菌接种后培养温度及发酵液pH值的影响红法夫酵母的最佳生长及虾青素积累温度为20，pH为50，而环状芽孢杆菌的最 适生长及产酶温度为30一35，pH为6570。由表3中可以看出，接种环状芽孢杆 菌后若温度仍保持20，则红法夫酵母可继续积累虾青素，但芽

10、孢杆菌产酶酶活极低，虾 青素提取率也非常低。当温度升高到30以上，虽然虾青素产量略有下降，但由于所产 胞壁溶解酶酶活较高，提取率可达到85以上，抽提出的虾青素总量较高，因此在环状芽孢杆菌接种后可将培养温度调到30一35。表4则表明接种后pH值控制在65时，可使虾青素的提取率较高。24环状芽孢杆菌接种量的影响环状芽孢杆菌接种量大时，生长迅速，酶活也可达到较高；但若接种量过大，环状芽 孢杆菌所产的大量胞壁溶解酶最终会导致红法夫酵母破壁过度，同时加上发酵罐中机械 搅拌的剪切、分散作用，造成部分虾青素从酵母菌体中渗透出来，分散在发酵液中，在离 心提取时损失，所以造成提取率虽然高，但实际提取所得虾青素总

11、量偏低。表5结果显 示，当接种量为20一30mL(1010个单细胞mL)时较为理想。l表1红法夫酵母培养不同时间后接种环状芽孢杆菌对胞壁溶解酶酶活及虾青素提取的影响注：初始葡萄糖浓度209L，环状芽孢杆菌接种后混合培养48h，接种量20raL，接种后温度25，pH55426 第四次全国发酵工程学术讨论会注：红法夫酵母培养72h后接种环状芽孢杆菌，接种后培养48h，接种量20mL，接种后温度25"C，pH55表3环状芽孢杆菌接种后培养温度对胞壁溶解酶酶活及虾青素提取的影响注t初始葡萄糖浓度309L，红法夫酵母培养72h后接种环状芽孢杆菌，接种量20mL，接种后pH55，培 养48h。裹

12、4环状芽孢杆菌接种后培养基pH值对胞壁溶解酶酶活及虾青素提取的影响注：初糖浓度309L，红法夫酵母培养72h后接种环状芽孢杆菌，接种量20mI,，接种后培养48h，温度30表5环状芽孢杆菌接种量对胞壁溶解酶酶活及虾青素提取的影响注；初始葡萄糖浓度309L，红法夫酵母培养72h后接种环状芽孢杆菌，接种后培养48h，温度30，pH65蹇华丽等：红法夫酵母与环状芽孢杆菌混合培养破壁提取虾青素的研究4273结论通过对红法夫酵母与环状芽孢杆菌两阶段混合培养条件的优化，得到适宜的培养基 初始糖浓度为399L，环状芽孢杆菌的最佳接种时间为红法夫酵母培养6072小时之 间，接种量为30mL(1010个单细胞m

13、L)，接种后最适培养温度为30，pH为65，总发酵 时间为120小时，在此条件下，红法夫酵母虾青素最终产量可达到89602pgL，虾青素 最终提取率可达到968。结果表明两阶段混合培养破壁提取虾青素效果较好，而所采 用培养基为无碳培养基加入葡萄糖，相对廉价，进一步对其培养工艺进行优化改造及开 发更加廉价的培养基原料，极有望实现虾青素提取工业化。参考文献Miller MW，nyam M，Soneda Mfat，Syst Bateriol，1976，26，286-291Okagbue RN，Lewis MJ，Biotechnol Lett。1983，5，731736 Okagbue RN，Lewi

14、s MJ。，Appl Bacteriol，1985，59。243-255Tony JFang，Joh-Ming Wang-ProcessBiochemistry，2002，3712351245m嘲嘲叫嘲 Akiko Nishi，Kazuhiko Ohbuchl，Masaaki Hamaehi，and Chieko Kumagai，Seibutsu-kogaku，199977，60-65E63 蹇华丽，朱明军等，高校化学工程学报。2006。20(1)。“71517 黄伟坤，食品检验与分析，北京t中国轻工业出版社，1989，583-584 E83 Dueteh C E，Parry JM，JG删Mi

15、crobi01，1974，80259268Abstract：Results of the two-stage batch mixed cultures of Pha f lta rhodozy ma ATCC 66270 and Bcirculans A13832 indicated that the suitable incu bation time and glucose concentration for Pha fta rhodozyma cultivation in the first stage were 60 h72 h and 30 gLDuring the second st

16、age of the mixed culture，10 mLL(1010 cellsmL)inoculum of Bcirculans A13832 supported the highest extractability of astaxanthinThe optimal temperatureand pH for the astaxanthin extraction in the mixed culture were 30and pH65，respectively，and the total fermentation time was 120 hUnder these conditionsthe