药学专业毕业论文外文翻译(I)

1、本科毕业论文(设计)外文翻译学 院 专 业药学专业姓 名 学 号 指导老师 职 称 合作老师职 称外文题目（原文）Activation of the p38 pathway by a novel monoketone curcumin analog,EF24, suggests a potential combination strategy译文：通过新型的单一酮姜黄素类比物，P38途径的激活作用表明一种有潜在可能的结合策略Activation of the p38 pathway by a novel monoketone curcumin analog,EF24, suggests a p

2、otential combination strategy摘要：“姜黄素”的抗癌效果以及这种自然产品抑制癌细胞扩散的能力受到越来越多的关注。新型姜黄素模拟物已经发展，以优化母体混合物的试管活动，但还保持着安全属性。EF24，氟化的综合模拟，超过了姜黄素本身抑制癌细胞通行以及神经系统对刺激的反应。我们将报告P38中介的信号发送途径在决定肺癌细胞对EF24过敏中的重要作用。我们已经发现肺癌细胞通行中EF24诱发减少是由伴随的，蛋白激酶已被增强的ERK1/2,JNK和P38磷酸化作用证明。通过药理学调查，我们认为依次通过P38活化作用，EF24引发了负面效应。为支持这一模式，P38的抑制作用，或者通

3、过小分子抑制因子或者通过RNAi调解的拆装式方法，提高了A549细胞中EF24引起的细胞死亡。所以，P38的抑制可能提高EF24的抗癌效果。事实上，一种P38抑制因子，即EF24和SB203580的结合，协同抑制A549肺癌细胞的克隆形成活动，并减少了细胞死亡。这些研究提供了一种新型策略，那就是把姜黄素模拟EF24与P38抑制因子结合为提高肺癌治愈疗效。简介：由于自身具有消极调节癌症相关的生物指标的性能以及抑制肿瘤细胞扩散并且保持在活的有机体内的药理安全，它已经证实了作为中介有巨大的可能性，然而，临床研究表明姜黄素在活的有机体中并不是那么有效，因为超过80%的这类化合物没能实现体循环，但是可以

4、被很快排出。这又促进了模拟设计，包括氟化模拟，EF24(如图1A)。从生物学角度上说，它在体外测定引发细胞死亡中有积极作用，并且在活的有机体里很有效。6,7。大量研究正用来引导这些类似物行为机制，尤其是EF24,以至于能推进这种药剂作为有发展前景的治疗药物的发展。像姜黄素，EF24抑制了NF-KB信号发送途径8，9。NF-KB途径与其他细胞内途径的相互作用已经广泛研究了。NF-KB似乎与分裂激化蛋白激酶途径相关10,11。.MAPK途径是三层的激酶调节系统，通过细胞外信号受到激化，诸如生长因子，最终导致相应的生物反应。MAPK的三个主要成员是细胞外调节激酶/分裂活化蛋白激酶（ERK/MAPK）

5、,c-jun N终端激酶（JNK），以及P38MAPK，ERK的激活作用已经与细胞生长分化相关联；然而JNK经常被压力信号激活。JNK和P38不仅可以对细胞分裂素作出反应，还可以对很多细胞压力包括煽动性细胞性因子作出反应12。近来，p38又被牵扯进NF-KB的转录上流调节中，进一步暗示了炎症、癌症以及NF-KB的联系13,14。像其他MAPKs,P38被MAP激酶激活，和MKK3、MKK6一起成为两大主要MAPKKs上流领域15。P38反过来又激活许多下流领域的基板，包括MAP激酶活化的蛋白激酶-2（MAPKAPK-2/MK2）,转录因子-2（ATF-2）,分裂素和压力激活激酶(MSK)以及P

6、5316,17。P38在人类癌症中的作用似乎很复杂。已发布的数据呈现P38是促进细胞生存还是加速细胞死亡的争论。然而，又有很多报道说与正常组织相比，P38在非小型细胞肺肿瘤中是有选择性地被激活。所以，它有可能涉及恶性肿瘤细胞的生长和转换18。在MAPK抑制剂发展中作出的巨大努力导致了P38抑制剂为治疗风湿关节炎、皮肤病及其他炎症有了评估19,20。P38抑制剂被发现可以抑制前炎症性细胞因子的生成，于是可以抑制炎症反应的传播。有趣的是，化合物的生物活性物质，很久之前就被证实有抑制细胞因子生物合成的能力，并已经被作为模板用来涉及新型P38抑制剂，这是目前在临床研究中使用的21。包括SB203580

7、和SB202190的生物活性物质，为其结合部位与ATP竞争，有选择性地以无所不在的P38a和P38b亚型为目标20,22,23。癌症细胞很受化学疗法影响，细胞死亡依赖于细胞死亡和生存机制之间的平衡。增长的生存信号可能抵消药物疗效。例如，通过紫杉酚的NF-KB诱导已经很好地被证明并且收到了很大关注24。紫杉酚被证明会引起IKB的磷酸化作用和退化，导致NF-KB异质二聚体的核置换。增强的NF-KB激化可能引起紫杉酚抵抗力25,26。另外，最近的报告表明NF-KB抑制剂增强了紫杉醇在子宫癌中的疗效27,28。在EF24作为抗癌中介的作用方式研究中，我们注意到，和EF24一起的细胞治疗极大地引发了三条

8、主要MAPK途径的上流调节，主要是ERK,JNK和P38。药理中介的调查表明决定细胞对于EF24反应中P38的重要作用。事实上，EF24和P38抑制剂结合展现了对肺癌细胞线A549的协同细胞毒性。所以，P38途径阻塞可能提供具有发展前景策略为提高基于EF24疗法的功效，为癌症治疗和多种炎症。1.材料及方法1.1 化学药品和抗体姜黄色素和类似物EF24合成如前所述6。储备溶液在DMSO中制作并被储存在零下20度中。化合物先于每项实验在孵化媒介中很快稀释。大部分化学药品来自，其他如述所说。生物活性物质化合物SB203580和SB202190被用作P38a/B抑制剂。1.2细胞文化人类非小型细胞肺癌

9、(NSCLC)细胞线A549在RPMI-1640中生长。10%细胞FBS维持在37度温度并含有10%二氧化碳的空气中。其中煤质由1%的青霉素/链霉素补充。1.3免疫印迹分析细胞在1%的NP-4en20中的5%脱脂0缓冲器中细胞溶解，由一个完全的蛋白酶抑制剂鸡尾药片做补充，其中来自整个细胞萃取物中的每10毫升容易和蛋白质被12.5%的SDS-PAGE转变，电化为硝化纤维膜，和TBS-Twe干奶阻塞。印迹会和首要的抗体孵化，接着是成对辣根过氧化物酶次要抗血清，这种抗血清来自圣克鲁兹生物技术。免疫反应性被增强的化学发光反应物直观化。由于连续的吸取额外的抗体，细胞膜被剥去，使用缓冲溶液（2%SDS,5

10、0mM Tris-HCI,pH 6.8）和2-硫基乙醇(1:1000),并且和显示的抗体再次探索。1.4 体内生存能力试验细胞放置在一个密度为5000个以上细胞/ 96孔板的盘子上，或者1000个细胞/384孔板的，并允许一整夜都放着。接下来一天细胞将以药物一式三份处理，持续两天或者三天。类似的IC50测试值可以A549细胞的48或72小时试验中获取（图S1）。细胞生存能力用B测得。细胞固定在4度的50ul的10%的三氯乙酸中一小时。盘子用清水洗净，用4%浓度的SRB染色。1%浓度的醋酸用来清洗盘子。最后，增加无缓冲的三异丙基乙磺酰来溶液染色。使用96孔板的阅读器来记录为490nm的吸光率。每

11、次处理的平均数和标准误差就被决定下来，控制相关的细胞生存能力可以计算出。IC50被定义为药物的浓缩，与细胞培养后期相比，可以杀死50%的总细胞数量。1.5 成株试验A549细胞放置在一个密度为450个细胞/ 12孔板的盘子上，并允许一整夜都放着。接下来一天细胞用测试化合物处理，自那以后每三天一次测试。在群落形成后的第10天，细胞固定在4度的10%三氯乙酸中30分钟。用清水洗净，并用B染色，再用1%浓度的醋酸清洗。细胞群落用如想处理器和Java分析法计算。大细胞群落有大于或等于2毫米的直径；小的是小于2毫米的直径。1.6流式细胞术分析用流式细胞术的碘化丙碇检测DNA来检查细胞死亡。A549细胞用

12、单个药剂或结合物处理48小时。附加的或为附加的细胞被手机，用1%浓度的BSA/PBS清洗，用75%浓度的冰乙醇固定至少1小时。PI(50ug/ml)用来给细胞染色，这些染色的细胞DNA用FACScan细胞计数器和细胞探索软件检测。1.7细胞健康试验A549细胞在96孔板的盘子里培养，用Hoechst33342(5ug/ml),PI(2.5ug/ml)和YO-PRO-1(0.1uM;试剂盒，卡尔巴斯德，CA)在4度的温度中染色30分钟，并用分子装置系统分析。单一PI和YO-PRO-1正极细胞被分别认为是坏死的和早期死亡细胞。然而PI/YO-PRO-1双倍正极细胞被称为晚期死亡细胞29。由坏死的和

13、早期晚期的死亡细胞组成的活细胞和死亡细胞的百分比能被分析。1.8siRNA转染根据制造商说明，A549细胞用寡核苷酸P38siRNA短暂地转染，并使用寡核苷酸转染试剂。接下来48小时的初期转染，A549细胞经历免疫蛋白印迹。对于SRB细胞生存能力试验，细胞经历两轮同样的转染。然而，在第二次转染之后，细胞用EF24处理48小时。1.9试管内P38激酶试验P38重组激酶用测试化合物提前培养30分钟。测试化合物是SB203580(0.078-40uM)或加上EF24(0.078-40uM)。P38用ATP和外源基质MBP的混合物培养，在30°度夏15分钟。反应由合模20ul的反应混合物加到

14、个别提前准备好的条状磷酸纤维素P81纸停止。然后磷酸纤维纸用0.5%浓度的磷酸清洗3次，15分钟，为去除未合并的ATP。MBP中未合并的ATP用液体闪烁计算检测。2结果2.1 EF24引起三条MAPK路线激活作用EF24在抑制A549细胞生存能力时比母体化合物姜黄素更加有效，这和前次报告相一致（图1）7。为了理解有助于EF24有效抗癌活动的原理，我们分析了可能在治疗上用这种药剂调解的路线。 之前，我们已经证明了EF24下流调解引发的NF-kB活动，通过反面调解IkB,IKK的逆向激酶活动。交互调节得知是存在的，在调解细胞生存和繁殖活动中的NF-kB路线和其他重要的介质中，包括三层MAPK信号路

15、线。为确定EF24是否调解任何一个研究过的MAPK，我们检测ERK,JNK的激活状态,以及P38对EF24或姜黄素的反应。有趣的是，发现EF24以剂量方式引起MAPK的激活作用，这由逆向磷酸化作用揭示（图1C）。ERK，类似于P38,也被姜黄素激活，然而比EF24有更高的浓度（20uM vs.0.4uM, 50uM vs.0.8uM）。当时，剂量使用了，但是用姜黄素治疗法没有发现JNK的磷酸化作用，反而在和EF24（5uM）的细胞治疗后发现了JNK的激活。姜黄素缺少感应的JNK与已经公布的数据一致。姜黄素不是激活，而是抑制了信号转化路线，并导致了JNK激活30,31。2.2ERK抑制和JNK激

16、活没有明显影响EF24引起的细胞毒性既然ERK加入了有丝状分裂的路线，促进了细胞生存和繁殖，而且EF24引起了ERK的激活，我们能确定这个路线对EF24的有效性是否重要，ERK的抑制是否可以进一步说明已处理过的EF24细胞生存能力的缺失。这次试验中选用了低剂量的EF24(0.4uM),因为它只引起了低水平的细胞增长抑制（15-25%），以及在48小时的治疗之后可检测到的MAPK激活。U0126的化学抑制剂用来有选择性地抑制ERK,通过以上游激酶MEK为目标。这个研究中U0126的使用浓聚物将用来决定抑制EF24引起的ERK磷酸化作用（数据未显示）。当细胞的生存能力用来和EF24、U0126的结

17、合物想比较，用ERK抑制的细胞生存能力中没有观察到明显的变化（图S2A）。另外，发现增加5uM的U0126在EF24中可以减少ERK和P38的蛋白质成分。这次结合很有可能抑制ERK路线的稳定化，其原理需要进一步的调查。类似地，我们决定JNK抑制作用是否会影响EF24引起的细胞毒性。几个最近的报告显示激活JNK的死亡反应调解细胞死亡的感应32。假设JNK的抑制作用可以降低EF24引起的细胞死亡。A549细胞与EF24和JNK抑制剂SP600125结合48小时。JNK抑制作用通过EF24没有降低细胞生存能力，反而在细胞生存能力中引起了轻微的减弱（图S2C）。通过JNK抑制剂的反应影响了细胞生存能力

18、，可能是因为JNK在A549细胞中促进细胞生存的作用，或者化合物SP600125的不明确作用。这种化合物显示出能抑制另外一些细胞激酶33。2.3 P38抑制剂提升了EF24引起的细胞毒性我们估计了P38抑制作用在EF24引起的细胞毒性的影响。使用EF24的相同低剂量（0.4uM），如同前一次实验中MEK和JNK。把EF24与不断增加的咪唑P38抑制剂结合，或者与SB203580和SB202190结合。P38抑制剂单独作用在测试浓度时并不影响细胞的生存能力。当SB203580与EF24结合，增长的抑制百分比会明显高于每个化合物单独的影响（图2A）。SB202190（12.5uM）和EF24的结合

19、在细胞生存能力中有着明显的作用（图2B）,这表明细胞生存能力大约30%的减少，低于额外的结合作用。由于P38抑制剂的细胞毒性，为确定结合是否会产生作用，把靠剂量作用的咪唑在A549细胞生长中的作用相比较。实验发现SB203580在A549细胞的细胞存活中有轻微的影响，并检测出最高浓度（25uM），这只会导致细胞生存能力10%的减弱以及大约50uM的IC50（图2C）。从相同的分析中看出，SB202190有大约25uM。当小分子抑制剂在实验中使用时，认识到警惕措施需要采取很重要。虽然SB202190和SB203580在细胞生存能力中有不同的作用，但在P38作为ATP模拟的抑制有着相同的原理。据文

20、件记录，有一系列其他目标时，SB202910作为激酶抑制剂有更多的混杂性33，可能导致信任，关于为什么SB203580在相关实验记录中作为P38的特殊抑制剂是一直被使用。这个情况在下列事实中会比较明显：关于A549细胞生存能力（大约分别是25uM和50uM）的抑制，SB202190和SB203580有不同的IC50测试值，而SB202190更具细胞毒性。EF24和SB203850结合的协同效应可能更足以反应出P38抑制活动的结合以及EF24的治疗。基于这个原因，SB203580作为实验的替代品。通过检测MAPKAPK-2的磷酸化作用，SB203580的P38抑制活动被证明是P38的直接顺流效应

21、物（图2D）。化合物中P38的抑制作用明显增加了EF24的效果。SB203580虽在A549细胞生存能力中影响最微弱，但是却始终抑制P38活动，此种化合物在接下来的实验中使用。2.4 EF24引起的细胞死亡是增强的P38抑制作用EF24已经被证明在癌症细胞的各种仪表板中引起细胞死亡（5,6）。通过EF24与P38抑制剂结合而增强的细胞毒性可能有引起细胞死亡的功能。我们使用以流式细胞仪为基础的实验来检测细胞G1部分水平，作为细胞死亡的指示，并检查EF24与SB203580结合是否会引起增强的细胞死亡反应（图3A&B）。细胞和EF24（0.4uM）处理，或SB203580（12.5uM）,

22、存放48小时并没有表明在仪器控制中细胞死亡的百分比有显著性差异。然而，当这两者物质相结合，可以观察到在G1部分中有细胞的协同累积。在姜黄素和姜黄素加SB203580治疗群体时没有发现G1细胞有明显的增加（图3A&B）。于是，基于内容分析法的细胞成像和细胞死亡的生物化学标记用来证实上述结果。基于双重染色法的内容分析能够区别细胞死亡和坏死的细胞。事实上，基于成像分析表明细胞用结合法处理主要经历了细胞死亡（图3C）。为了证明上述观察，A549细胞和P38抑制剂的结合处理又增强了EF24引起的PARP分裂。这是构建良好的效应凋亡蛋白酶基质，又是细胞死亡的另一个标志（图3D）。通过EF24和SB

23、203580结合作用而增强的PARP分裂表明蛋白酶调解的细胞死亡加速。为证实这一模式，我们确定抑制全部蛋白酶活动是否能减弱结合所引起的细胞生存能力。在细胞与EF24和SB203580处理的48小时前，我们用聚丙烯腈蛋白酶抑制剂zVAD-fmk提前1小时处理A549细胞。蛋白酶抑制剂的提前处理明显阻碍了细胞死亡，但证明了蛋白酶调解的路线（图3E）。然而，这种蛋白酶抑制剂只表明了50%的保护作用，表明有另外的细胞死亡原理在内，并要求进一步的调查。在这些试验中，同样的P38抑制剂SB203580不能提高姜黄素功效，这与P38不是姜黄素引起的观察相一致。2.5 P38抑制使A549细胞对EF24引起的

24、细胞死亡敏感化P38抑制剂的小分子可能引起逆反作用，这可能引起EF24活动的加强。为检测这个可能性，我们使用基因方法来特别检查P38。A549细胞用siRNA处理，这会导致P38的明显拆解。P38siRNA的相关特异性被检查。事实上，观察ERK水平没有观察到其他激酶中有变化（图4A&B）。那么，这些P38拆解细胞用来检测在EF24（0.4uM）细胞敏感性上引起的P38作用(图4C)。在细胞用检测中介处理后，细胞生存能力会得到分析。P38拆解的作用用来和siRNA的模拟转染控制相比较。如图3C所示，P38抑制提高了对EF24的细胞敏感度，表明细胞生存能力的明显减弱，这与EF24和SB20

25、3580的结合类似。这些结果都说明，为证明肺癌细胞存活，P38在EF24处理中可能提供反馈循环。P38调解的负面反馈原理降低了对EF24的抵抗，可能导致提高治疗功效。2.6 EF24与SB203580结合协同抑制肺癌细胞的群落形成P38抑制作用可能降低对EF24的细胞抵抗。为估计可能的治疗后果，我们检查了P38抑制在EF24成株试验中A549细胞的转换活动的抑制功效。IC50为抑制A549细胞的群落形成，大约有来自前次实验150nM的EF24和10uM的SB203580（数据未表明）。对于这次实验的结合处理，100nM的EF24被使用。为得到细胞生存能力实验中EF24和SB203580的比率（

26、1：32.5，如图2A）,5uM的SB203580在本次实验中选用。如图5A&B所示，EF24与SB203580结合明显减少了细胞群落形成的数量，大约50%左右，相当于群落的整体大小。所以P38抑制提供了可能的策略，用来提高EF24对抗肺癌的反肿瘤活动。4讨论肺癌是导致全球死亡率上升的一个主要因素，很多人被确诊为晚期或转移性非小细胞肺癌。目前，对于这种特殊肺癌的治疗方法是有限的。在当前研究中，我们使用了A549恶性肺癌肿瘤细胞线，它是用于非小细胞肺癌的细胞模型，为的是证明EF24比重要的化合物姜黄素有更高的细胞毒性。有趣的是，我们的工作又证明P38引发的恶性回馈循环可能限制Ef24的功

27、效。通过使EF24引发的上升型P38失去效果，它可能提升EF24的功效。事实上，与吡啶咪唑P38抑制剂结合时(图3)，EF24产生了一种A549细胞的协同增长抑制和细胞死亡感应。这个研究不仅为我们提供临床环境中可能有用的潜在结合，但是需提供几个重要的观察，这观察是关于EF24与A549细胞相对的机制。增强的特殊苏氨酸磷酸化作用以及每个激酶中激活循环的铬氨酸基序表明ERK、JNK和P38信号路线被激活回应EF24治疗。虽然ERK在调解细胞存活和繁殖中有着广泛的作用，但是ERK激活不能加强EF24的功效来抑制A549细胞生长（图S2）。另外，JNK被认为是一种一种促进细胞凋亡的激酶，但是我们的研究

28、表明JNK抑制活动与EF24结合有轻微的添加剂（图S2）。我们希望JNK抑制能减弱EF24的抗癌活动。从这个观察中得出的一个结论是要么JNK激活对于EF24调解细胞死亡不必要，要么EF24诱发的JNK有促进细胞存活的功效。34,35。然而，化学抑制剂的非特殊性质SP600125一定能够使数据阐释复杂化36。由于P38与NF-KB转录激活连接，P38已经部分卷进存活线路中了。P38在COX-2中的感应参与和细胞因子的生物合成，例如TNF和IL-6支持P38在炎症中的重要作用37,38。我们证明了SB203580，我们研究中使用的P38抑制剂原型，阻碍了EF24引发的P38活动。这已被MAPKAPK-2磷酸化作用的抑制所证明。SB203580没用研发中影响A549细胞的生长，表明P38抑制没有影响细胞扩散。P38活动的并发抑制与EF24的结合促进了A549细胞的死亡。因此，P38在A549中有促进细胞存活的功能。核染色在流式细胞仪以及在裂开的PARP中的增长证实了在引发细胞死亡中这