生物芯片技术及其在水产动物病原检测中的应用畜牧渔业论文

1、生物芯片技术及其在水产动物病原检测中的应用-畜牧渔业论文生物芯片技术及其在水产动物病原检测中的应用 徐晓丽，邵蓬，丁子元，包海岩，任涵玮，宋昀鹏，张勤 （天津市水产技术推广站，天津 300221） 摘要：生物芯片是近年来迅速发展的一项新技术，以高通量、高灵敏性和特异性的优势，在生物大分子功能研究、食品安全检测、病原微生物检测和鉴定、药物筛选等方面发挥着越来越重要的作用。本文对生物芯片技术的原理、种类、发展历程及其在水产动物病原检测领域的应用做一综述，以期为水产动物疾病快速诊断的研究提供新思路。 关键词：生物芯片；水产病害；病原检测 生物芯片是20世纪90年代初应人类基因组计划而发展起来的一种全

2、新的微量分析技术，它综合了分子生物技术、免疫学、物理、微加工技术、化学、计算机等多项技术，使生命科学研究中不连续的、离散的分析过程集成在芯片上完成。生物芯片技术最大的特点是高通量并行分析，能够大规模获取生物信息，为生命科学从分子水平向细胞乃至整体水平的研究搭建了一座桥梁，也为人类基因组学从理论向实用研究的过渡提供了技术支持1。 生物芯片的主要研发工作在美国，以基因芯片为先导，1992年美国人Stephen Foder研制出了第一块基因芯片，1998年美国政府正式启动基因芯片研发计划，许多政府部门、大学和研究机构参与其中，一些国际大公司如Affymetrix、Hyeq、Incyte、Nanoge

3、n、Hewlett Packard等对生物芯片技术在基因多态性、疾病相关性、基因药物开发、合成及天然药物筛选等领域投入较大精力，并有相应的产品问世。国内生物芯片研究起步较晚，但得到了政府部门的大力支持，科技部医药生物技术“十五”及2015年规划所列的15个关键技术项目中，有8个项目涉及生物芯片。国家的 “973”计划、“863”计划、自然科学基金计划、火炬计划等项目都有与生物芯片相关的研究经费投入。目前，全国已有大约20多家研究机构、30多家生产企业进行了生物芯片的研发工作，形成了北京、上海、西安、广州四个研究中心。 1生物芯片简介 生物芯片的制作与应用主要有以下4步2：生物芯片制备、待检样品

4、的处理、芯片与样品的生物反应、芯片反应信号的检测。芯片矩阵的构建为在一块大小不等的玻璃片、硅片、塑料片、尼龙膜或凝胶等载体材料上，以大规模阵列的形式固定不同的生物分子(寡核苷酸、cDNA、基因组DNA、多肽、抗原、抗体等)，形成可与目的靶分子互相作用、并行反应的固相表面。待检测的生物样品大多成分复杂，不能直接与芯片上的生物分子反应，均需经过提前处理，纯化其中的蛋白质或提取扩增其中的核苷酸，或者对目的生物分子进行生物标记。将芯片与待检靶生物分子进行化学反应(如杂交、免疫反应等)后，反应结果的检测要依据标记的报告分子种类来选择不同的检测设备。荧光标记是芯片信息采集中最常用也是最成功的报告分子，杂交

5、反应信号可由激光共聚焦显微扫描仪或CCD(charge couple device)相机收集，芯片上每个反应点的荧光强弱通过计算机软件将荧光信号转换成数据，从而获得相关的生物信息。生物芯片技术为生物学研究提供了高通量的技术手段，现已在医学领域病原体检测、耐药基因、基因分型、基因表达谱分析、药物筛选、肿瘤诊断等显示出广阔的应用前景。 2生物芯片的发展 二十多年来，在各国学者的共同努力下，生物芯片技术发展迅速，技术也更加成熟和完善，应用领域也在逐步扩大，从单一的寡核苷酸芯片到cDNA芯片、基因组芯片，从表达谱分析芯片到病原检测、药物筛选芯片。随着人类基因组序列的完成，生物全基因组测序技术的成熟，人

6、们逐渐意识到，在这个后基因组时代，功能基因组学虽为主要研究内容，然而生命活动的进行最终要由蛋白质来执行，基因水平的研究只能反映基因表达水平的变化，并不意味着由它翻译的蛋白质的水平也会发生相应的变化，蛋白质要经过转录、翻译、剪切、修饰加工等多步复杂的步骤才能真正发挥功能。因此，要想对生命活动进行全面而深入的研究，必定要对蛋白质进行研究，研究其结构、功能以及在一定生理或病理条件下、不同组织器官中的表达量、表达活性等。然而，生物体内蛋白质种类繁多，结构复杂多变，分析难度较核酸大为增加，由此诞生了蛋白质芯片。此后又陆续出现了芯片实验室(lab-on-a-chip)、细胞芯片、组织芯片、糖芯片等3。 2

7、.1基因芯片 基因芯片是采用原位合成或显微点样技术，将许多特定的寡核苷酸、DNA序列作为探针有序的、高密度的固化于芯片载体表面，与经过标记的核酸分子杂交，通过分析杂交反应信号，从而获得所检测样品中的遗传信息。基因芯片(Gene chips)是生物芯片(Biochip)技术中研究最深入、实用性最强、最先投入应用的技术之一。作为一种先进的、大规模、高通量的检测技术，应用于疾病的诊断，具有高度的灵敏性和准确性，还可同时检测多个样品的多种病原，检测所用样品量极少，短时间内即可提供大量的疾病诊断相关信息，为疾病的诊断提供了新的思路4。Cleven等5报道了一种DNA芯片用于检测血液中金黄色葡萄球菌、大肠

8、杆菌、绿脓杆菌，芯片上固定有120种特异性基因探针包括编码看家蛋白的基因、细菌毒力基因、抗生素耐药基因，对42个临床样本的检测结果证实该芯片能准确识别病原菌及其耐药基因；Baner等6介绍了一种可同时检测口蹄疫病毒（口蹄疫）、猪水泡病病毒和水疱性口炎病毒的DNA微阵列，能够准确识别3病毒及其亚型，结果与之前鉴定的血清型一致；Wilson W J等7制备了一种可准确识别18种原核生物、真核生物和病毒的多病原体识别芯片，待检样品经PCR扩增目的基因并标记后，与芯片杂交，可检测低至10 fg的PCR产物；Gustavo等8设计了一款名为GreeneChipPm的长核苷酸芯片，其上固定约3万条60-m

9、er长的探针，直接针对病原包括病毒、细菌、真菌的RNA进行检测，是能够检测微生物种类最广泛的基因芯片。 2.2蛋白质芯片 又称蛋白质微阵列（Protein microarray），是将多肽或蛋白质分子主要包括抗原、抗体、酶、受体等，固定于处理后的固相载体表面所形成的微阵列，主要是利用蛋白质之间的相互作用来检测样品中的目的生物组分。蛋白芯片在生物功能基因组学研究中，是作为基因芯片功能的补充而发展起来的，研究的最初目的是比较细胞在不同生理或病理条件下蛋白质表达的异同，对相关蛋白质进行分类和鉴定，发展相对较慢，但比较容易发展成临床有诊断价值的低密度芯片9。目前蛋白质芯片技术已广泛应用于蛋白质功能研究

10、、病原检测、药物筛选、信号转导通路等领域的研究。在疾病诊断领域，Xu等10制备了可同时检测5种肝炎病毒的免疫芯片，证明其具有良好的检测准确率和临床应用价值；Jiang 等11利用抗原-抗体特异性反应原理，建立了抗体芯片，用于血清中TORCH 感染病原特异性IgM的检测，灵敏度可达0.24 g/mL，检测结果同经典的ELISA方法符合率在95%以上；Zhou等12采用抗体芯片检测直肠癌抗原并进行分型；Ozgur等13制备抗体微阵列检测血清中心血管病相关标志蛋白；左小霞等14建立的免疫芯片技术方法，检测葡萄球菌肠毒素A、B的最低检测限均为1 ng/mL。总之，蛋白芯片以其快速、敏感、高通量、低成本

11、等优势，将会极大推动动物疾病诊断、病原检测领域的研究。 2.3芯片实验室（lab on a chip） 芯片实验室是指采用了微流控芯片的分析系统，亦即微全分析系统，是把整个生化分析过程的多个步骤集成于一张几平方厘米的芯片上，包括待检样品的处理、样品与芯片的生化反应、信号检测等操作，在这张芯片上完成不同的生化学反应，并对产物进行分析，从而实现对核酸、多肽、蛋白等生物组分的高通量连续检测的目的15。Manz和Harrison等16是微流控芯片的开拓者，最先以毛细管电泳作为微流控芯片的形式，开展了相关的研究工作。其后，研究人员将毛细管电泳在上样、生化反应、产物分离、集成检测等诸多方面进行了研究并取得

12、突破性进展，使之更适用于芯片电泳，现今，微流控芯片已实现了上千个阀和几百个反应器的大规模集成17。可以看到这种芯片最接近生物芯片概念的核心理念，但芯片实验室的真正实用化还有很长的一段路要走。 2.4组织芯片 组织芯片是将几十到上千个不同个体的组织标本规则的排列在同一个固体支持物，形成阵列的形式，进行相关的分析研究，从而在一张芯片上高通量获取组织学、DNA、RNA和蛋白质表达的信息。具取材微小，信息含量高等优点，并可根据不同的需要设计组合，将基因、蛋白水平的研究与组织形态学相结合；实验误差小、试剂用量少，但组织芯片也存在供体蜡块不易保存、芯片组织片的大小对供体的代表性不足等缺陷。目前，组织芯片的

13、研究以恶性肿瘤芯片为主。Hans 等18用6种抗体对包含152个样品的组织芯片分别进行免疫组化分析，研究B细胞淋巴瘤的分型，结果证实分析效果与cDNA芯片相当，这是对cDNA芯片发现的B细胞淋巴瘤表达标志物进行的蛋白水平验证；Moskaluk等19采用组织芯片结合免疫组化，检测肿瘤相关蛋白Cdx2在正常和病变组织中的表达，其结果与采用寡核苷酸微阵列所得到的RNA表达水平一致。因此，组织芯片与免疫组化、原位杂交等技术相结合，可与基因芯片、蛋白芯片或其他技术组成一个可高通量分析蛋白表达的可靠系统，基因芯片或蛋白芯片从同一种细胞或组织经高通量研究其成千上万个基因和蛋白质变化所筛选出的具有潜在意义的基

14、因分子，组织芯片可迅速测试其临床价值，评估其生物学作用。 2.5细胞芯片 细胞微阵列芯片可看做是基因芯片和蛋白芯片应用的延伸。由细胞芯片裸片、封装盖板和底板构成，细胞芯片裸片上密集设置6 00010 000乃至更高密度不同细胞阵列，封装于盖板和底板之间，从而在芯片上实现对细胞的精确控制与运输; 完成对细胞的特征化修饰；实现细胞与内外环境的交流和联系。细胞芯片已经在基因检测、基因表达、组分多态性分析、药物开发筛选和疾病诊断等诸多领域显示出重要的作用，在白血病等肿瘤的辅助诊断和预后判断方面也有着重要的应用价值。马静红等20应用细胞芯片捕获人正常胃细胞系、胃癌细胞系细胞并检测其细胞表面CD表型的差异

15、；Zhang等21利用红细胞为材料研究了细胞免疫芯片在细胞检测方面的初步应用；Revzin等22运用光刻胶技术在玻片上构建了聚乙二醇水凝胶壁组成的微孔，并使微孔内的玻片选择性地结合淋巴细胞特异性抗体或其他细胞黏附因子，形成高密度抗体或细胞因子芯片。 3生物芯片在水产动物病原检测中的应用 目前，国内外的学者对于生物芯片技术在水产养殖动物疾病病原的检测领域的应用研究，尚处于起始阶段，仅在一些常见的、危害较大的细菌性和病毒性疾病检测上有所应用。Gonzdlez等23将多重PCR技术和DNA芯片技术结合，构建了一种能够同时检测创伤弧菌、鳗利斯顿氏菌、美人鱼发光杆菌、杀鲑气单胞菌、副溶血性弧菌5种海水鱼

16、病原菌的DNA微阵列，该微阵列由9种短链寡核苷酸探针(25-mer)组成，最低可检出低于20 fg的PCR产物；Warsen等24根据细菌16 S rDNA设计寡核苷酸探针，将其固化于芯片载体上构建的基因芯片，能100%的特异性的检测出18种细菌（包括15种鱼类病原菌）；Panicker等25基于创伤弧菌的vvh 和viu B基因、霍乱弧菌的omp U、 tox R、tcp I和hly A基因以及副溶血弧菌的三个溶血基因和ORF 8基因设计的DNA芯片，可用于墨西哥湾地区水体及牡蛎这三种细菌性疾病的检测，可检测至102 到103 CFU/mL浓度的纯培养的菌液，结果准确可靠；李君文等26基于细

17、菌16S rDNA的可变区设计核酸探针制备的基因芯片，可快速检测出水体中的副溶血弧菌、军团杆菌、李斯特菌、变形杆菌、耶尔森氏菌等常见致病菌；2005年日本水产综合研究中心开发出能够快速诊断38种鱼类病原菌的基因芯片，其中20种为淡水鱼病原菌27；在水产动物病毒检测方面，刘荭制备了可同时检测2个样品中12种常见淡水鱼类病毒如鲤春病毒、传染性胰脏坏死病毒、草鱼出血病病毒等的基因芯片，可极大地提高检疫工作的效率和水平28；Ronan等29将miniarray 技术引入对虾病毒检测中并优化了杂交反应的条件和洗涤过程，杂交反应只需20 min，可同时检测出对虾WSSV和IHHNV。 在蛋白芯片方面，国内

18、自2006年开始进行水产动物病原检测免疫芯片的研究工作，Xu等30-31制备了对虾白斑症病毒(White Spot Syndrome Virus， WSSV) 检测免疫芯片、鱼类淋巴囊肿病毒(Lymphocystis disease virus，LCDV) 检测免疫芯片以及现场检测免疫芯片，在对养殖生产中WSSV和LCDV的监测中，检测准确率在98%以上，对WSSV的灵敏度最低可达12.38 ng/mL；黄荣夫等32建立了一种可准确检测水体中副溶血弧菌、河流弧菌和大肠杆菌的蛋白微阵列；李永芹等33制备了可同时检测杀鲑气单胞菌、链球菌、鳗弧菌、迟缓爱德华氏菌、荧光假单胞菌、海分支杆菌6 种鱼类常

19、见病原菌的检测免疫芯片，检测结果肉眼可见，无需专门的仪器设备和专业技术人员，在水产动物病原的快速、准确、简便、现场的检测应用方面，具有广阔的应用前景。 4问题与展望 生物芯片技术应用于水产动物病原检测领域，具有快速、灵敏、准确等优势，对样品的需要量非常少，甚至可以在不杀死养殖动物的前提下进行；且针对目前水产动物疾病的发生往往由多种病原共同作用引起的现状，生物芯片可实现多个样品多种病原的平行检测，根据检测结果对疾病即可做出较为准确的诊断，对疾病的预防和治疗具有重大意义。然而现在的生物芯片，虽然后期的应用操作较为简单，但前期研发费用较高，芯片上所固定的基因或蛋白（抗体）种类越多，费用也相对越昂贵，

20、因此多样本、高通量的生物芯片技术在实用性上还有一定的局限性。而且生物芯片要在养殖生产中得到广泛的应用还有许多问题需要解决，如提高检测的可靠性和灵敏性，简化待测样品的处理过程，降低成本，检测结果的分析还没有系统的方法以及构建稳定的生物芯片尤其是蛋白质芯片等。但生物芯片技术在短短十几年，已经在多个领域得到了不同程度的发展和应用，引起了越来越多学者的关注，相信随着科技的发展和研究的逐步深入，生物芯片及其相关产品会对人类社会的各个行业产生深远的影响，带来巨大的经济和社会效益。 参考文献： 1 石锐,孙凯,王秀荣,等.生物芯片在疾病诊断中的应用J.畜牧兽医科技信息,2005（5）:7-8 2 Sipar

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