生物科学专业毕业论文微核形成与细胞周期关系的初步研究

1、目 录摘要4关键词4Abstract4Key words51. 选题背景51.1 课题来源51.2 国内外的相关研究51.3 目的和意义81.4 课题设计指导思想82. 方案论证82.1方案的设计原理82.2 方案论证93. 材料与方法103.1 材料与仪器103.2 实验步骤114. 结果与讨论144.1 实验结果144.2 结果与分析175. 结论与心得175.1 结论175.2 心得17参考文献2021 / 21文档可自由编辑打印摘 要微核是真核生物细胞中的一种异常结构,他是各种理化因子，如辐射、化学药物对分裂细胞作用的结果。一般认为微核是起源于落后染色体与丧失着丝粒的断片，在有丝分裂末

2、期形成。但是另一些实验则表明间期细胞也可形成微核。本课题通过体外培养人的外周血淋巴细胞，在细胞周期的特定时期注射环磷酰胺20ug/ml，观察淋巴细胞微核形成与细胞周期的关系;实验结果证实了细胞周期的各时期都可能有微核形成。关键词：环磷酰胺；淋巴细胞；细胞周期; 微核AbstractMicronucleus are the abnormal structure, which usually are the result of all kinds of physical-chemically factors such as radiation，chemical medicine to mitoti

3、c cells. Micronucleus is generally believed that behind the origin and loss of centromere chromosome fragment, formed in late mitosis. However, while some other experiments on cells that can form between the micronucleus. This topic through in vitro of peripheral blood lymphocyte, In the cell cycle

4、of specific period 20ug/ml cyclophosphamide injection, Observe lymphocyte micronucleus formation and the cell cycle. The results confirmed the cell cycle may have different periods micronucleus formation. Key Words: Cyclophosphamide; Lymphocytes; Cell cycle ；Micronucleus.1 选题背景1.1 课题来源生命科学学院 王洪振老师1.

5、2 国内外的相关研究1.2.1微核的研究状况微核是指位于细胞浆中独立于主核的核小体，其染色同主核，但比主核淡，其直径小于主核13，主要由外界损害因素(生物、物理、化学)作用细胞后，导致细胞染色体丢失或断裂，从而在胞浆中形成1个或数个小核1。因此，微核试验在对外来化合物(如药品、食品添加剂、农药、化妆品、环境污染物等)遗传毒性和职业暴露人群遗传损害监测和现场生态环境检测方面，在诊断和预防肝癌、食管癌、肺癌等恶性肿瘤方面得到了大量的应用。微核试验最大的优点是经济、简单、快速，而国内外大量的对比试验研究，比较一致的看法是该方法在敏感性、特异性和准确性方面，与经典的染色体畸变分析方法基本相当2。因而，

6、特别适合作为大量化合物和现场人群初筛的实验方法。微核试验创建于20世纪70年代中期(19731975)3,4，目前许多国家和国际组织，已将其规定为新药、食品添加剂、农药、化妆品等毒理安全性评价的必做实验58。近年来，随着分子生物学技术的迅速发展和渗透到微核研究中，大大拓展了微核试验的检测和应用范围，已发展成为能同时检测染色体断裂、丢失、分裂延迟、分裂不平衡、基因扩增、不分离、DNA 损伤修复障碍、Hprt基因突变、凋亡、细胞分裂不平衡等多种遗传学终点的检测，因而近年来国际上有人提出了新微核试验概念9，从而大大拓展了微核试验的应用范围10,11。当然，要实现一个实验多个遗传损害终点的检测，需要更

7、多的新的技术手段配合，如FISH技术、图象分析技术等等，这也对我国的实验室条件和研究水平提出了更高的要求。由于大量新的化合物的合成，原子能应用，各种各样工业废物的排出，使人们很需要有一套高度灵敏，技术简单的测试系统来监视环境的变化。只有真核类的测试系统更能直接推测诱变物质对人类或其它高等生物的遗传危害，在这方面，微核测试是一种比较理想的方法。目前国内外不少部门已把微核测试用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等各方面。微核试验已成为检测药物、放射线、有毒物质的遗传毒性，反映其对人体细胞或体外培养细胞遗传学损伤的一个重要方法。近几年，随着DNA碎片的分析、细胞

8、凋亡的研究、单克隆抗体的应用、人类基因组学研究和肿瘤基因组解剖计划进一步丰富了微核理论。1.2.2 微核形成的机理微核形成的机理微核形成的机理，多数学者认为微核主要来源于染色体畸变中的无着丝粒断片和单条或多条染色体。曹佳等采用电镜、BrdU标记、DNA探针杂交等技术1214，对微核结构、功能进行了较系统的研究，发现部分淋巴细胞微核具有一定的结构和功能，部分微核具有DNA复制能力，不同诱变剂诱导的微核具有不同的染色体组成，并有一定的规律性。如非整倍体断裂剂(化学诱变剂)诱导的微核，主要由丢失的整条染色体组成；染色体断裂剂(物理因素)诱导的微核，主要由染色体断片组成。化学诱变学说：当细胞受到化学诱

9、变剂作用后，造成染色体断裂或有丝分裂器(主要指纺锤丝)的损伤，在细胞分裂后期，此断片和染色体不能被纳入子细胞核，形成游离在胞质中的小核(微核)。纺锤丝毒性类药物如秋水仙碱、HO一221等直接抑制动物细胞纺锤丝的形成，阻止细胞分裂中期纺锤丝将染色体拉至细胞的两端。Ando等n应用抗肿瘤药(HO一221)抑制纺锤丝微管组装，破坏纺锤丝，结果在染色体分析时诱导出多倍体和亚二倍体细胞，未见染色体断裂，鼠体内细胞也常被诱导出较大的微核。有机苯能引起微核增多且有明显的致癌作用，苯三酚(1，2，4一苯三酚，BT)在氧化成醌时产生活性氧损伤DNA 和其它一些细胞大分子，实验中BT能使淋巴细胞微核率上升2倍，使

10、HK一60细胞微核率上升8倍，且总微核数两类细胞呈剂量相关性增高，BT不仅引起染色体数目和结构的变化，而且通过产生新氧间接引发点突变。此外，我们用不同浓度的重金属砷、铅、锰、汞溶液对人外周血淋巴细胞染毒试验，发现微核在一定浓度范围内呈显著升高趋势；通过对电焊工、油漆工、汽车司机、炼油厂职工这些有害因素接触人群微核的检测，我们也发现其微核率明显高于健康对照组；我们通过对化疗患者外周血淋巴细胞微核监测，发现其化疗前、化疗中和化疗后有明显的变化(设健康对照组)，可见化疗药物具有明显的致畸致突变作用。细胞组成成分缺乏学说：有作者对9位健康志愿者进行了叶酸限量试验，从基础用量的195 mgd，减少到56

11、 mgd，维持5 w，然后慢慢补充叶酸，减量后的双核淋巴细胞和全系淋巴细胞内的微核频率均增高，且着丝点阳性和阴性的微核都增加。当叶酸补充后，两类细胞微核率明显下降，着丝点阳性微核变化更为显著。实验表明，低叶酸血症在临床贫血症状之前，就出现了血液和口腔黏膜细胞遗传物质损伤口引。可见其二者之间呈负相关，而血浆半胱氨酸浓度与微核率呈正相关，低维生素D导致血液细胞遗传物质损伤15，微核率升高。由此可见，DNA合成过程所需原料的缺乏(关键酶、核苷酸以及膜完整性所需成分等)均可导致微核升高。染色体畸变断片学说：主要指电离辐射(包括X，中子，a)，体内外细胞受照射后，导致遗传物质损伤，可诱发微核形成，由此可

12、见这也是微核形成的一个重要因素16，17。研究资料表明，电离辐射诱发的微核主要是断片形成的，其原因是电离粒子穿透染色体或其附近时，是染色体分子电离发生化学变化而断裂形成断片，最终形成微核，主要是有氧增强自由基增多所致。微核又是细胞凋亡产物，当程序性死亡基因被激活，随之Ca 依赖性内切酶激活切割DNA，形成细胞核碎片，形态学表现为核深染，染色质边缘分布的帽形核，最后导致无数微核。经过我们多年对放射工作者、核生产厂矿及核爆试验人员外周血淋巴细胞微核观察，发现放射工作人员淋巴细胞微核细胞率、微核阳性检出率均显著高于正常健康对照组，受意外照射人员微核明显增高，淋巴细胞微核细胞率、微核阳性检出率与放射工

13、龄呈陆线正相关关系，与个人年受照射剂量呈直线正相关，与个人累积受照剂量直线正相关。膜损伤学说：有的学者认为，辐射作用于核膜的某一部位，使之变薄、穿孔，由于张力的作用，使核内容物从受损膜部位向外突出、延伸、收缢，最终连丝断裂而形成微核。国际上普遍认为微核来源于染色体断片或丢失的整条染色体，根据这一理论，细胞必须经过分裂后，才能观察到微核。但国内薛开先采用放射自显影、间期细胞及各周期微核定量分析等手段，于1986年首先提出了间期细胞可以以核芽突方式形成微核学说。曹佳使用BrdU标记和电镜技术，也证实了这一途径可以解释部分微核的形成13,18,19。两学者的工作同时认为：这一途径与染色体断片和染色体

14、丢失形成微核理论并不矛盾，都是遗传物质的丢失，具有相同的遗传毒理效应。根据这一新的论点，在人群监测中采集的外周血不需培养，即可直接在外周血淋巴细胞中观察到微核的存在。基因突变学说：这里主要指病毒感染，可引起基因突变，蛋白质和酶的变化，从而影响DNA的复制，诱发染色体畸变形成微核。DNA损伤和修复在机体维持动态的平衡，通过研究自发微核率与性别、年龄的关系，我们发现人体微核呈偏态分布，说明细胞存在自发突变，微核随年龄增加，不受性别影响，此外，逆转录现象的发现和核酶的研究，加深了我们对中心法则的认识，拓宽了RNA病毒致癌、致病的研究。病毒癌基因、细胞癌基因和癌基因活化机制，以及细胞凋亡机制的深入研究

15、，也是对此学说的有力证明。无论何种学说，都认为微核是核物质，并有DNA合成能力。当细胞微核作为一种评价指标用于辐射损伤、药物筛选、肿瘤防治的实验研究, 使它形成“微核测定法”被肯定以来, 人们就越来越关心和重视细胞微核在各种因素作用下形成机理的探讨。1.3 目的和意义微核实验从建立开始就因为其灵敏、稳定，且能检测染色体完整性改变和染色体分离改变两种遗传学终点而得到广泛应用，随分子生物学技术的发展，现已成为可检测多终点的分子毒理学方法。在非整倍体毒剂检测、致突变物筛选和外来化合物生物毒作用机制研究等领域有广阏的应用前景。诚然，目前微核实验还存在：用于检测微核着丝粒和端粒的DNA探针的特异性和灵敏

16、性不十分满意、尚不能全面分析微核来源于哪条染色体、微核自动化分析费用高等局限性；然而，随新DNA探针的不断发现、多色荧光原位杂交和计算机辅助的激光共焦显微分析技术的发展，通过微核实验能更细致、快捷地检测微核的染色体来源。评价外来化台物的毒性作用。微核试验已成为检测药物、放射线、有毒物质的遗传毒性，反映其对人体细胞或体外培养细胞遗传学损伤的一个重要方法。近几年，随着DNA碎片的分析、细胞凋亡的研究、单克隆抗体的应用、人类基因组学研究和肿瘤基因组解剖计划进一步丰富了微核理论，但研究范围仍局限于幼红细胞、成熟淋巴细胞及体外细胞株。随着微核试验检测范围的进一步拓宽，新微核试验正向我们走来，我国学者应加

17、强对这一方法的研究，加大新技术示范与推广的力度，以缩小与国际同行研究的距离。1.4 课题设计指导思想本试验的目的是为了掌握微核试验的基本原理和基本技能，通过研究环磷酰胺诱导人的外周血淋巴微核形成，判断微核在细胞周期的哪个时期形成或哪个时期微核率（MNF）最大。2 方案论证2.1 方案的设计原理本试验选取人的外周血淋巴细胞作为试验对象，观察环磷酰胺对其影响以及微核的产生，判断微核在细胞周期的哪个时期形成或哪个时期微核率（MNF）最大，以及微核的一些性质研究。2.2 方案论证2.2.1 实验对象的选择微核实验的研究对象已从骨髓红细胞扩展到多种在体细胞和离体培养细胞。过去认为红细胞成熟过程中能把主核

18、排出胞外微核滞留在胞内，易于识别，而外周血中的含微核红细胞又常被脾脏清除，所以常规微核实验以小鼠骨髓嗜多染红细胞为研究对象。80年代后发现小鼠脾脏不能有效清除含微核红细胞小鼠外周血红细胞微核实验结果与骨髓嗜多染红细胞微核实验有较好的一致性。显然前者更简便。并可对同一动物进行多次采样分析。目前，该方法已被国际组织普遍接受，日本学者还直接分离小鼠血中微核进行有关微核染色体组成的研究23。最近还发现红细胞也可把微核排出胞外。并且被排出的微核主要来源于整条染色体24。随技术发展，已能有效识别有核细胞中的微核。人外周血淋巴细胞、实体组织活检细胞、组织脱落细胞(口腔、泌尿道)微核率等能在一定程度上反映射线

19、及外来化合物等对某些器官造成的遗传毒性损害，对肿瘤的研究、诊断均有较大参考价值，许多研究把它们作为生物剂量监测指标。生殖细胞(主要是精子)微核率，由于其特殊的遗传地位，亦有较多研究报道。培养细胞微核实验避免了个体差异因素的影响，易于控制实验条件，操作简便。体外培养的血淋巴细胞、各种哺乳动物细胞系、原代肿瘤细胞、肝细胞及蚕豆根尖、紫露草等植物细胞等已广泛用于微核实验研究。总之，可根据实验需要选择合适的细胞进行微核实验研究。2.2.2 实验研究的方法细胞动力学阻滞微核分析:1985年Feneeh等建立了该方法，用胞质分裂阻滞剂阻断胞质分裂，但不影响胞核分裂，有丝分裂细胞呈特殊形态的双核细胞，未发生

20、核分裂的细胞则维持单核细胞形态。检测致突变固索作用后的双核细胞率和双核细胞做核率，可同时获得致突变因素对细胞的遗传毒性损害和对细胞周期影响的信息。这一方法倍受青睐迅速得到广泛应用，不仅与后面提及的免疫荧光和原位杂交技术配合运用，可以准确分辨微核来源，判断姐妹染色单体在子代细胞的分市。而且，通过观察双核细胞的两个子代核间是否有染色质桥，可检测染色体分离障碍；用阿糖胞苷抑制DNA切除修复，观察双核细胞微核率的变化，可检测DNA双链损伤情况及DNA切除修复缺陷；观察含6一琉基嘌呤的培养基中生长的双核和多核细胞率可以检测HPRT基因突变情况25。免疫荧光微核分析:硬皮病患者血清中含有抗着丝粒(anti

21、kinetochore antibodies)，能特异性地与人和一些哺乳动物的着丝粒蛋白结合，通过免疫荧光技术检测微核中是否存在着丝粒蛋白，可初步判断微核来自于整条染色体还是染色体断片。由于硬皮病患者常有明显的CREST征(即钙质沉着、雷诺现象、食管能动性障碍和指、趾硬皮病等)，这种方法也称CREST染色。1986年Vig26 等首先报道了这一方法，其后很多研究采用了这种方法，我们也用这种方法分析了昆明山海棠和丙烯酰胺诱导的微核27,28。由于这种方法检测的是着丝粒蛋白，如果化合物能使着丝粒蛋白失活或合成受抑，就会导致假阴性结果。已有研究表明丝裂霉素c(mitomyein c)、5一氮胞嘧啶(

22、5一azacytidine)、地西泮(diazepam)、甲胺嘧啶(pyrimethamine)和氢酿(hydroqnone)等均可通过上述途径导致着丝粒阳性微核率下降。然而，这种方法简便易行，当受试化合物对着丝粒蛋白无影响时，还是相当准确可靠，所以受到不少学者推崇。荧光原位杂交微核分析:用着丝粒DNA探针或同时应用着丝粒和端粒DNA探针，通过荧光原位杂交，检测做核着丝粒和端粒信号，可准确判断微核来源于整条染色体还是染色体断片，推测微核所含染色体和断片的数目。应用染色体特异性DNA探针，可检测姐妹染色单体在于代细胞的分布(包括染色体丢失和染色体不分离)，分辨微核内是否含有某几条染色体。从而深入

23、分析诱导微核形成的理化因素的遗传毒性及毒作用靶位等。原位启动DNA合成微核分析:用寡核苷酸引物，通过少数几轮PCR原位扩增目的DNA序列。并掺入地高辛标记的dUTP，如荧光原位杂交一样地度微核内的着丝粒或端粒呈现荧光信号。Russo等用这种方法检测了丝裂霉素C和秋水仙素诱导的小鼠脾细胞着丝粒和端粒组成，认为这种方法灵敏度高，重复性好并且更快捷。对微核细胞进行凋亡检测:凋亡是一种由遗传调控的细胞生理性死亡机制，由于一些癌基因和抑癌基因参与了凋亡的调控，引起了人们的广泛关注。尤其是P53基因，它既参与了DNA损伤所致的细胞周期阻滞和凋亡，也是维持基因组稳定性所必需。有研究认为P53还与微核形成有关

24、。细胞遗传物质受损伤可能出现：仍能正常分裂、微核和非整倍体形成、发生凋亡。可见，凋亡也是遗传毒性损伤后续效应的一个重要指标，评估化合物遗传作用时，进行细胞凋亡率检测有重要意义。3 材料与方法3.1 材料与仪器3.1.1 药物与试剂环磷酰胺粉末（针剂），生理盐水，0.5KCl溶液，蒸馏水，甲醇，冰醋酸，Giemsa原液，1mg/ml Brdu，PHA粉末（针剂），1 ug/ml秋水仙素，灭活小牛血清。3.1.2 仪器与设备试剂瓶，烧杯，量筒，玻璃棒，注射器，滴管，10ml离心管，镊子，酒精灯，手套，口罩，离心机，电子天枰，光学显微镜，37培养箱，超净台，酒精灯，移液抢，冰箱, 试管架 ，定时钟，

25、脱脂玻片，火柴等3.2 实验步骤3.2.1 溶液的配置一常规溶液(一)1/15mol/L PBS(磷酸缓冲液Phosphate Buffer Solution，PBS)甲液：1/15mol/L Na2HPO4溶液Na2HPO4 9.465g蒸馏水 加至1000ml乙液：l/15mol/L KH2PO4溶液KH2P04 9.07g蒸馏水 加至1000m1分装在棕色瓶内，于4冰箱中保存，用时甲、乙两液各按不同比例混合，即可得所需pH的缓冲液,见下表:pH 甲液ml 乙液mI pH 甲液ml 乙液mI 5.29 5.59 5.91 6.24 6.47 6.64 2.5 5.0 10.0 20.0 3

26、0.0 40.0 97.5 95.0 90.0 80.0 70.0 60.0 6.81 6.98 7.17 7.38 7.73 8.04 50.0 60.0 70.0 80.0 90.0 95.0 50.0 40.0 30.0 20.0 10.0 5.0(二)10gml秋水仙素 秋水仙素 lOmg生理盐水 100ml装入茶色瓶中，为贮备液，4冰箱中保存。甩时取贮备液1ml加生理盐水9ml即可。(三)Giemsa染液 1贮备液Giemsa粉 1g 纯甘油 66ml 甲醇 66ml 先将Giemsa粉置于研钵中加少量甘油，充分研磨，呈无颗粒的糊状。再将全部甘油加入，放入56温箱中2小时，然后加入甲

27、醇，保存于茶色瓶中。一般两周后使用为好。 2工作液 临用时将贮备液与pH6.8的磷酸盐缓冲液按照1:20混合。 二、细胞培养液(一)0.01molLPBS(磷酸盐缓冲液Phosphate Buffer Saline，PBS)pH7.2。0.2molL磷酸氢二钠液(甲液)： NaH2PO412H2O 35.814g双蒸水 加至500ml0.2molL磷酸二氢钠液(乙液): NaH2PO412H2O 15.601g 双蒸水 加至500ml 取甲液36ml，乙液14ml和NaCl8.2克，加双蒸水至1000ml。混匀待完全溶解分装，经高压灭菌后保存于4冰箱备用。 (二)Hanks液 1原液甲 NaC

28、l 160g KCl 8g MgSO47H2O 2g MgCI26H2O 2g 溶于800ml馏水中。 CaCl2(无水) 2.8g 溶于100ml蒸馏水中。 将两种液体混合后，加水至1000ml用滤纸滤过，再加2ml氯仿防腐，置4冰箱备用。 原液乙 Na2HPO412H2O 3.04g KH2PO4 1.2g 葡萄糖 20.0g溶于800ml蒸馏水中，用滤纸过滤，然后加0.5酚红80ml，再加水至1000ml，最后加入2ml氯仿防腐，置4冰箱备用。(三)1640培养液(含lO小牛血清) RPMI-1640粉 10.39g 双蒸水 加至1000ml 通入适量的C02气体，边通入CO2边慢慢搅拌

29、，使其(呈透明)完全溶解。用NaHCO31.5克调pH值到7.2。 双抗100u/ml 10ml 灭活小牛血清 110ml 混匀上述液体，立即用G6抽滤除菌分装，置4冰箱备用。 (四)BrdU溶液(200ug/m1) 用无菌青霉素瓶，在室温下称取1.0mg，在无菌条件下加入灭菌生理盐水9.0ml，溶解，混匀，用黑纸包严，避光置冰箱冰格中保存。最好用时现配。（五）环磷酰胺溶液从冰箱中取一只注射用环磷酰胺粉末（剂量为0.02g），用20ml的超净水溶解，使得环磷酰胺浓度为10mg/ml。由于使用时的浓度为1mg/ml，因此使用时稀释10倍即为成为配制成1mg/ml环磷酰胺溶液。（六）制片固定液甲醇

30、：冰醋酸(3：1)混合液，现配先用。（七）外周血淋巴细胞培养液的配置将两瓶肝素40ml,每瓶加10ml小牛血清，配置成20%的小牛血瓶培养液，封口，放入4冰箱储存3.2.2 取血及外周血淋巴细胞的培养 抽取健康男性的静脉血各5ml,分别加入到3个培养瓶（装有50 ml 20%的小牛血瓶培养液），血液加入培养液后摇匀（不能太剧烈）分装。因此每个时期有三组。1、G0期：分装8ml加血液的培养液，不加PHA，接种后立刻加入1mg/ml环磷酰胺0.2ml，在37培养箱中培养18-24h收获。2、在剩下的血液培养液中加入一支PHA（先用2ml超净水溶解）。、G1期：分装10ml加血液的培养液，立刻加入1

31、mg/ml环磷酰胺 0.2ml在37培养箱中培养22h收获。、S.G2期：分装20ml加血液的培养液接种后在37培养箱中培养48h收获。其中培养20h-24h后，加入1mg/ml环磷酰胺 0.4ml;收获前 2.5-3h，加入1 ug/ml秋水仙素1.05ml;收获前30min，加入1mg/ml Brdu 0.33ml。、M期：分装10ml加血液的培养液接种后在37培养箱中培养46h，加入1mg/ml环磷酰胺0.2ml，收获前 2.5-3h，加入1 ug/ml秋水仙素0.53ml ,收获前30min加入1mg/ml Brdu 0.17ml。3.2.3 外周血淋巴细胞微核制片1、收集培养物：培养

32、时间满时取出培养瓶，轻轻去掉瓶盖，用带帽滴管吸去每瓶上清液(1.0ml)，然后两瓶平行标本合并移入l0ml离心管内。如培养物取出时已混，则两瓶混匀后移入l0ml离心管中，与对照平衡后1500转/分离心5分钟，吸去上清留底液。2、低渗：往已有2ml培养物离心管内加入0.5KCl溶液8ml，混合后放37oC保温低渗10分钟。 3、预固定：低渗后加固定液0.5ml，混匀后1000转/分离心5分钟，用滴管去掉上清(要尽量把上清去净，但不能丢失沉淀物)。 4、固定：将沉淀物轻轻混匀后，沿离心管壁加入固定液并迅速轻轻与沉淀物混合，有块状物要打散，然后加固定液至34ml，盖上盖，放37保温固定15分钟。固定

33、后以1000转/分离心5分钟，取出后去上消(要尽量把上清去净，但不能丢失沉淀物)，如此反复再固定2次。 5、制片：第三次固定后去上清，留沉淀物0.20.4ml，混匀后用滴管吸取分别滴在己预冷的玻片左右各三分之一处，轻轻吹散，然后通过火焰固定，即为未染色标本，备用。3.2.4 染色 本试验采取Giemsa染色，待骨髓片自然晾干之后，用新鲜配制的PH7.4的磷酸盐缓冲液的10%的Giemsa染液染色1015min，染色完毕后用蒸馏水冲洗，自然晾干即可。3.2.5 观察结果先以低倍镜，选择细胞分布均匀、疏密适度、形态完整、染色良好的区域，然后再在高倍镜下对实验结果进行拍照。4 结果与讨论4.1实验结

34、果4.1.1环磷酰胺（诱导微核照片：micronucleusmicronucleus图4-6 Go期 hp（1） 10010 图4-7 Go期 hp（2） 10010micronucleusmicronucleus 图4-1 G1期 hp（1） 10010 图4-2 G1 期hp（2） 10010micronucleusmicronuclesus 图4-3 微核增值期 hp（1） 10010 图4-4 S期 hp（2） 10010micronucleus 图4-5 G2期 hp 10010 micronucleusmicronucleus 图4-8 M期hp（1） 10010 图4-9 M期

35、hp（2） 100104.1.2微核计数4.1.3淋巴细胞细胞周期各时期的微核率4.2结果与分析实验结果表明: 细胞周期各阶段均可有不同程度的微核形成, 其中最多的是G1期, 其次是G2期，其他各时期均可能形成较少量的微核。S期细胞的微核率较G1期有极显著的下降,这提示大部分G1期的微核细胞不能进人S期, 使细胞增殖中止, 这可能是抗癌药物杀伤肿瘤细胞的机制之一。图4-8M期微核照片一定程度上证明了微核起源于落后染色体与丧失着丝粒的断片。5 结论与心得5.1结论细胞周期的各个时期均可形成微核, 其中微核最多的时期是G1期, 其次是G2期。 S期细胞的微核率较G1期有极显著的下降,这表明大部分G

36、1期的微核细胞不能进人S期, 使细胞增殖中止，这为预防治疗癌症肿瘤有很深远的意义。5.2心得5.2.1 归纳总结在制片的过程中，要将玻片事先放入冰箱，准备好冰片。制片以滴片的方式进行，使用冰片是因为冰片的效果要好于普通玻片。5.2.1.2 染色本试验采取Giemsa染色，在染色时应注意将染色液覆盖满整个玻片，使得染色过程进行得更为充分。同时也要在玻片下面垫上纸片，以免Giemsa染液对实验台造成污染。染色时间应该不低于15分钟，用蒸馏水冲洗染液时，应该让蒸馏水以细小的水流均匀的从玻片一端冲下，并且不能让水流直接接触被染色的细胞，以免将细胞冲走。5.2.2 尚存在的问题经过了资料查找与总结，方案的提出与修改，以及实验这几个阶段，最终得出了一些实验的结果，但是在实验过程中发现了许多的问题和大量有待于改进的地方。5.2.2.1 染色方法的使用进行微核试验时，一般会选择Giemsa染色，feulgen染色以及吖啶橙荧光染色这三种染色方法。本试验中采取的是简单，易操作的Giemsa染色，虽然这种方法尤其突出的优势，但是也存在一些不足。一般来说，这种染色不能分辨细胞中的DNA、RNA以及其他的嗜碱性颗粒，因此容易产生假阳性现象，高估嗜多染红细胞中微核产生的水平。由于试验时间，实验室条件等因素的限制，本试验只采取了一种染色方法。希望在以后的试验中，能够采取几种不同染色的方法同时进