成骨、成脂诱导【精选文档】

1、成骨、成脂诱导【精选文档】间充质干细胞成骨及成脂诱导培养基标准制作方法· 浏览:185· · 更新：201307-01 11：12间充质干细胞培养细胞诱导分化时必然用到的就是培养液，配置出合适的培养液能够促进细胞的分化，因此这一步操作时相当的关键。如何才能配置适合的诱导培养液呢?济南中赛生物来介绍成骨与成脂诱导培养液的配备方法。成骨诱导培养液配备与诱导操作:1.准备含10%FBS的MEM培养液;2。在备好的-MEM培养液中添加50M 抗坏血酸, 10mm磷酸甘油和100nm地塞米松；3。准备6孔培养板,将P4细胞按照5×103个/平方厘米的规格接种于原始

2、MEM培养液中；4。待细胞长至基本融合后，更换上述制备完成的成骨诱导培养液；5。每三天换液一次,细胞长至7天时进行碱性磷酸酶染色;6。二十八天后再进行矿化结节的茜素红染色.茜素红染色方法介绍:1.去除细胞当前使用培养液，使用PBS清洗两次;2。使用10甲醛室温固定15分钟,完成后使用重蒸馏水冲洗两次；3。按照1ml/孔加入40mM的茜素红染色液，室温孵育20min并轻微振荡;4。清除掉没有完全结合的染料，用重蒸馏水漂洗并振荡5min重复4次；5。倾斜放置2min,吸取多余的重蒸馏水；倒置显微镜观察拍照记录.成脂诱导培养液配备与诱导操作：1.配置FBS10含量的HG-DMEM培养液；2.在配制完

3、成的HG-DMEM培养液中加入1M地塞米松，10g/ml胰岛素，200M吲哚美辛和0.5mM IBMX；3。准备6孔培养板，将P4细胞按照2×104个/平方厘米的规格接种于原始HGDMEM培养液中4.待细胞长至基本融合后,更换上述制备完成的成脂诱导培养液培养2天,在用只含有10g/ml胰岛素的成脂维持培养液培养1天,如此交替循环培养至14天，使用红油O染色。红油O染色方法介绍：1.去除细胞使用的当前培养液,使用PBS清洗两次;2.27。5甲醛室温固定20分钟;3.重蒸馏水清洗3此，空气中干燥；4.加入0。5%的红油室温孵育一小时；5。配制70乙醇溶液清洗3次；6.倒置显微镜观察拍照记

4、录.丁香园二、诱导成骨体系1试 剂  溶 剂  终 浓 度  储 存 浓 度  1ml体系加量Dex  去离子水  0。1M  1mM  0。1LVc  PBS  50M  50mM  1L-磷酸甘油  PBS  10mM  1M  10L2DMEM（HG）和10FBS.33代以

5、上细胞，,24孔板每孔105个细胞,六孔板每孔6000个细胞，每三天半量换液,共诱导2周。成骨诱导剂：地塞米松（1×108mol/L)，甘油磷酸钠10mmol/L、维生素C 50ng/ml，高糖DMEM，青链霉素各100u/ml，体积分数10的胎牛血清。成骨诱导培养基成分:兔骨髓间质干细胞成骨诱导分化基础培养基175 mL兔骨髓间质干细胞培养专用胎牛血清20 mL谷氨酰胺2 mL双抗2 mL抗坏血酸400 L甘油磷酸钠2 mL地塞米松20 L成脂诱导培养基成分：兔骨髓间质干细胞成脂诱导分化培养基A液兔骨髓间质干细胞成脂诱导分化基础培养基A175 mL兔骨髓间质干细胞培养专用胎牛血清2

6、0 mL谷氨酰胺2 mL双抗2 mL胰岛素400 LIBMX（IBMX, 3-异丁基1-甲基黄嘌呤)200 L罗格列酮(吲哚美辛）200 L地塞米松200 L兔骨髓间质干细胞成脂诱导分化培养基B液兔骨髓间质干细胞成脂诱导分化基础培养基B175 mL兔骨髓间质干细胞培养专用胎牛血清20 mL双抗2 mL谷氨酰胺2 mL胰岛素400 L对成脂肪诱导要特别提醒你，用国产血清比进口的效果更好（仍为10浓度)。我用的是SIGMA的地塞米松(D1756），25mg包装的,248元贵的惊人！须用无水乙醇溶解。我也用过病房常用的5mg的地塞米松磷酸钠，效果也挺好的。首选的是dexamethasone-wate

7、r soluble,cell culture tested。至少可以配成1：1000的母液，使用起来很方便。使用医用制剂尤其要小心溶剂的问题,好些制剂不是融解在水里的，如果你没有设置合适的阴性对照，会给你的实验带来Bug.脂肪诱导培养液：DMEM，10FCS,106M地塞米松，100微克ml 1一甲基一3一异丁基一黄嘌呤，50微克ml抗坏血酸.很难找到一套抗兔的抗体。油红染色的方法如下:脂肪油红染色（原位）：1.称取0。5g油红干粉，溶于100mL异丙醇中,配成0。5%油红储存液，棕色瓶保存.2.除去培养基用PBS洗涤1遍3.加10中性甲醛固定5min4.稀释油红储存液，油红；去离子水3：2，滤纸过滤，室温放置10min(除去一些杂质，染色结果更清晰）5。染色30min，如果是培养皿或培养板，加的体积覆盖住板底即可。如6孔加1。5ml，24孔加0.51ml.6。 显微镜观察，及时照相，时间过长，脂肪滴会自发破裂,到时就前功尽弃了，几个星期的努力欧！这位大虾的油红染色方法基本正确，但有几个地方修改一下后效果会更好！