蛋白组学技术

1、蛋白质组学研究技术蛋白质组学研究技术12生物制药第一组生物制药第一组主要内容主要内容蛋白质组学研究背景蛋白质组学研究背景1蛋白质组学定义及内容蛋白质组学定义及内容2蛋白质组学研究技术蛋白质组学研究技术3蛋白质组学研究进展蛋白质组学研究进展4 人类基因组计划结束给科学工作者极大鼓舞，同时也引出了更多的问题： 大量涌现出的新基因，它们有什么功能？编码什么蛋白？在生命过程中发挥什么样的作用？ 这些问题靠传统的研究方法不可能解决。蛋白质组（proteome)和蛋白质组学（proteomics)的概念就是在这个基础上提出的。一、蛋白质组学研究背景一、蛋白质组学研究背景二、蛋白质组学定义及内容二、蛋白质组

2、学定义及内容 蛋白质组学是蛋白质和基因组研究在形式和内容两方面的完美组合，该技术致力于研究某一物种，个体，器官，组织或细胞在特定条件，特定时间所表达的全部蛋白质图谱。2.1 2.1 蛋白质组学定义蛋白质组学定义 1994年，Marc Wilkim在Siena双向凝胶电泳(twodimensional electrophoresis，2-DE)会议上最早提出了蛋白质组(proteome)概念-是由一个基因组或一个细胞，组织表达的所有protein。2.1.12.1.1蛋白质组蛋白质组2.1.2 2.1.2 蛋白质组学（蛋白质组学（proteome)proteome)2.2 蛋白质组学研究内容蛋白

3、质组学研究内容 2.2.12.2.1蛋白质鉴定：蛋白质鉴定： 分子量及等电点分析 western blot 或者免疫共沉淀等技术初步鉴定蛋白质种类 质谱技术分析蛋白质的氨基酸序列 在数据库中对比确定蛋白质的家族归属2.2.2 2.2.2 蛋白质的修饰：蛋白质的修饰： 真核生物蛋白质翻译后会进行修饰：乙酰化 磷酸化 糖基化 这些修饰是调节蛋白质功能的重要方式2.2.3 2.2.3 蛋白质功能确定：蛋白质功能确定： 研究蛋白质的功能，蛋白质相互作用 酵母杂交技术 噬菌体展示技术 RNA干扰技术 三、蛋白质组学研究技术三、蛋白质组学研究技术 双向电泳技术双向电泳技术(2DE)(2DE) 荧光差异显示

4、双向电泳技术荧光差异显示双向电泳技术(2DDIGE)(2DDIGE) 蛋白质质谱分析技术蛋白质质谱分析技术(ESIMS)(ESIMS)1975 年,意大利生化学家OFarrell （奥法雷尔）发明了双向电泳(2-DE)技术。该技术应用两个不同分离原理为依据进行分离，即利用蛋白质分子的等电点(PI)和相对分子量的不同进行分离第一向电泳是蛋白质的等电聚焦，根据蛋白质等电点差异进行分离，该分离技术采用固定pH梯度技术(IPG)可以实现等电点只差001pH单位的蛋白质的分离；第二向电泳是利用蛋白质相对分子量差异进行分离，可分离相对分子量在100103150103的蛋白质。3.1 3.1 双向电泳技术双

5、向电泳技术(2DE)(2DE)例如：番茄种子空间搭载与地面后代叶片的差异蛋白质组研究。例如：番茄种子空间搭载与地面后代叶片的差异蛋白质组研究。CK-2CK-2是对照组，是对照组，MIR-2MIR-2是实验组。是实验组。图1用不同裂解液裂解后的CK-2双向电泳图左图裂解液中的去垢剂用的是CHAPS,右图裂解液中的去垢剂是NP-40。图2 对照样品CK以及和平号搭载样品MIR 的双向电泳结果图 样品MIR-2和对照组CK-2的双向电泳结果进行了IMAGE MASTER 软件分析, 共找到了42个表达差异2倍以上的蛋白质点,对其中26个差异比较明显的蛋白质点进行了ESIQ-TOF MS /MS质谱分

6、析, 共鉴定出10个蛋白质点, 鉴定的蛋白质在对照组均表现为上调, 在空间站搭载样品中表现为下调。3.23.2荧光差异显示双向电泳技术荧光差异显示双向电泳技术(2DDIGE)(2DDIGE) 荧光差异显示凝胶电泳(2D-DIGE)是一种新出现的荧光标记的定量蛋白质组学技术，比经典的2-DE 具有更高的动力学范围和灵敏性。该方法通过引入内标使得多个样品在一块胶上分离，进而减少了实验条件不一致引起的误差。DIGE 技术可检测到表达差异小于10的蛋白，统计学可信度达到95以上。 DIGE 系统基于荧光差异凝胶电泳(2D-DIGE)技术，是利用电荷和分子量的差异分离蛋白质混合物，并通过多通道激光扫描分

7、析不同蛋白质的第二向SDS-PAGE 凝胶图像。 DIGE 系统结合了新型荧光技术、样品多路技术(sample multiplexing)和图像分析等特有的技术，是一套优于经典的2-DE 的完整的系统。 DIGE的试验流程的试验流程3.3 3.3 蛋白质质谱分析技术蛋白质质谱分析技术(ESIMS)(ESIMS) 质谱分析技术是利用质谱仪使物质离子化成离子并通过适当的电场、磁场将它们按空间位置、时间先后或者轨道稳定与否实现质荷比分离，并检测其强度，从而对物质进行分析的技术。 质谱是带电原子、分子或分子碎片按质荷比的大小顺序排列的图谱。质谱分析技术的基本原理IonizerSample+_Mass

8、AnalyzerDetector MALDI SELDI Electro-SprayIonization (ESI) Time-Of-Flight (TOF) Quadrapole Ion-Trap ElectronMultiplier(EM)四、蛋白质组学的研究进展四、蛋白质组学的研究进展4.14.1 在基础研究方面在基础研究方面 近两年来蛋白质组研究技术已被应用到各种生命科学领域，如细胞生物学、神经生物学等。在研究对象上，覆盖了原核微生物、真核微生物、植物和动物等范围，涉及到各种重要的生物学现象，如信号转导、细胞分化、蛋白质折叠等等。在未来的发展中，蛋白质组学的研究领域将更加广泛。4.2 4.2 在应用研究方面在应用研究方面 蛋白质组学将成为寻找疾病分子标记和药物靶标最有效的方法之一。在对癌症、早老性痴呆等人类重大疾病的临床诊断和治疗方面蛋白质组技术也有十分诱人的前景，目前国际上许多大型药物公司正投入大量的人力和物力进行蛋白质组学方面的应用性研究。4.3 4.3 在技术发展方面在技术发展方面 蛋白质组学的研究方法将出现多种技术并存，各有优势和局限的特点，而难以象基因组研究一样形成比较一致的方法。除了发展新方法外，更强调各种方法间的整合和互补，以适应不同蛋白质的不同特征。另外，蛋白质组学与其它学科的交叉也将日益显著和重要，这种交叉是新技术