实验三植物细胞骨架的光学显微镜观察

1、实验三 植物细胞骨架的光学显微镜观察一、 实验目的了解细胞骨架的结构特征及其制备技术。二、实验器具及试剂1器具普通光学显微镜、50ml烧杯、玻璃滴管、容量瓶、试剂瓶、载玻片、盖玻片、镊子、小剪刀、吸水纸、擦镜纸。2试剂M-缓冲液：咪唑、KCL、MGCL2、EGTA【乙二醇双醚四乙酸】、EDTA、疏基乙醇或DTT(二硫苏糖醇)；（PH6.8）磷酸缓冲液（用NaHCO3调PH值）；Triton X-100，用M-缓冲液配制；考马斯亮蓝R250,其溶剂为：甲醇46.5ml、冰醋酸7ml、蒸馏水46.5ml；戍二醛、乙醇、叔丁醇、正丁醇、二甲苯、中性树胶等。3. 实验材料洋葱鳞茎三、实验内容细胞骨架事

2、由蛋白质丝组成的复杂网状结构，根据其组成成分和形态结构可分为微管、微丝和中间纤维。它们对细胞形态的维持，细胞的生长、运动、分裂、分化，物质运输，能量转换，信息传递，基因表达等起到重要作用。当用适当浓度的Triton X-100处理细胞时，可经细胞质膜中和细胞质中的蛋白质和全部脂质被溶解抽提，但细胞骨架系统的蛋白质不受破坏而被保存，经用戊二醛固定，考马斯亮蓝R250染色后，可在光学显微镜下观察到由微丝组成的微丝束为网状结构，就是细胞骨架。（一）溶液配制（1）M-缓冲液配制：M-缓冲液(10原液) ：咪唑34.04g，氯化镁 (MgCl26H2O)1.02g，EGTA（乙二醇双醚四乙酸） 3.8g

3、，EDTA (乙二胺四乙酸)0.29g，巯基乙醇0.78g (0.7ml)蒸馏水加至1 000 ml。使用时，取100 ml (10原液)加900 ml蒸馏水。（2）6mmol/L（PH6.5）磷酸缓冲液配制：甲液：NaH2PO42H2O，0.938g 溶于蒸馏水中，最后稀释至1 000ml。乙液：Na2HPO4 12H2O，2.15g加蒸馏水溶解，最后加水至1 000ml。取甲液685ml，乙液315ml加蒸馏水1000ml即成6mmol/LPH6.5的磷酸缓冲液。（3）1%Triton X-100，用M-缓冲液配制：取22ml Triton X-100液加M-缓冲液至200ml。（4）0.

4、2%考马斯亮蓝R250：考马斯亮蓝R250为0.2g，甲醇46.5ml、冰醋酸7ml、蒸馏水46.5ml（5）3%戍二醛，用磷酸缓冲液配制。（二）实验方法与步骤（1） 撕取洋葱鳞茎内表皮（约1cm2大小若干片）置于装有PH6.8磷酸缓冲液的50ml烧杯中，使其下沉。（2）吸去磷酸缓冲液，用1% Triton X-100处理2030min。（3）吸去Triton X-100，用M-缓冲液洗3次，每次10min。（4）3%戊二醛固定0.51h。（5）PH6.5磷酸缓冲液洗三次，每次10min。（6）0.2%考马斯亮蓝R250染色2030min。（7）用蒸馏水洗12次，细胞置于载破片上，加盖玻片，于普通光学显微镜下观察。（8）如观察效果好，可制作成永久切片。在有样品的50ml烧杯中，顺序通过如下药物：50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇、1/2V95%乙醇+1/2V叔丁醇、叔丁醇（每级5-10min）；或正丁醇、正丁醇、二甲苯、二甲苯（每级5-10min），然后捞取样品，平展于载玻片上，经镜检，