RNAi技术及实验操作

1、RNAi技术及其实验操作点击次数：252发布时间：2010-11-14 14:04:09RNAi技术及其实验操作目前对RNAi (RNA interference)的定义有很多种，不同的资料对其定义的侧重点也不尽相同，如果将RNAi看作一种生物学现象，可以有以下定义：RNAi是由dsRNA介导的由特定酶参与的特异性基因沉默现象，它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。RNAi是有dsRNA参与指导的，以外源和内源mRNA为降解目标的转基因沉默现象。具有核苷酸序列特异性的自我防御机制，是一种当外源基因导入或病毒入侵后，细胞中与转基因或入侵病毒RNA同源的基因发生共同基因沉默的现象。如

2、果将其作为一门生物技术，则定义为：RNAi是指通过反义RNA与正链RNA形成双链RNA特 异性地抑制靶基因的现象，它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA (有义RNA和反义RNA),从而诱导内源靶基因的 mRNA 降解，达到阻止基因表达的目的。RNAi是指体外人工合成的或体内的双链RNA ( dsRNA )在细胞内特异性的将与之同源的mRNA降解成21nt23nt的小片段，使相应的基因沉默。RNAi是将与靶基因的mRNA同源互补的双链RNA (dsRNA )导入细胞，能特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失 ，属于转录后水平的基因沉默(post - transcri

3、ptional gene silence , PTGS )。各种不同定义虽然说法不同，但所描述事实是大体相同的，简单地可以说，RNAi就是指由RNA介导的基因沉默现象。也就是说，RNAi技术是利用RNAi为原理，在体外利用化学或酶促合成siRNA，也可构建在体内合成siRNA的质粒或病毒表达载体，然后利用传统微注射磷酸钙法、电穿孔转染法、脂质体介 导转染等方法转染细胞从而致使靶基因沉默的技术。RNA干扰有很多方法：化学合成法：应用最广泛但成本昂贵，体外合成的长 21nt、3'端带有2个游离核苷酸的siRNA较其它形式合成的 RNA具有更大效 率的降解目的mRNA的效果。siRNA表达载

4、体：在质粒或病毒载体中，利用RNA聚合酶启动因子U6或T7分别控制正义链和反义链的合成并退火形成双链siRNA，或在启动子下游设计带发夹结构的表达单位，自身退火形成双链siRNA。dsRNA表达载体：多用于果蝇、线虫等低等生物，在体内表达后被Dicer 切割成21-23nt 的siRNA ;或在体外利用 Dicer、RNaseIII 切割dsRNA 产生siRNA，纯化后使用。最近由于RNA干扰(RNA interference ，RNAi )的发现使反义领域的研究增多。这种自然发生的现 象最早是在秀丽线虫中发现的，是序列特异性地使转录后的基因沉默的有力机制。RNA干扰是由长的双链RNA分子发

5、动的，该分子可以被 Dicer enzyme 加工成长度为 21-23 个核苷酸的RNA。RNaseIII蛋白 被认为是作为一个二聚体发挥作用，它对双链RNA的两个链都进行切割，酶切的产物3 /末端互相重叠。然后这种小的干扰 RNA分子(small interfering RNAs ， siRNAs )掺入RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex， RISC )，引导核酸酶降解靶 RNA。这种保守的生化机制可用于研究多种模式生物的基因功能，但是它在哺乳动物细胞中的应用受到阻碍，因为长的双链RNA分子会引起干扰素应答。因此Tuschi及其同事表明长度为

6、21nt的siRNA可以特异性 的抑制哺乳动物细胞基因表达是一个革命性的突破。这个发现激发了大量利用RNAi技术对哺乳动物细胞的研究，因为与传统的反义技术比，RNAi的性能明显较高。有趣的是，除了短双链 RNA，短发夹RNA (short hairpin RNA ，shRNA )，比如茎环结构在细胞 内经过加工后也可以变成 siRNA，从而产生RNA干扰。这使得构建表达干扰 RNA的载体，从而使哺乳动 物细胞内基因表达长期沉默成为可能。 shRNA可以利用RNA聚核酶III启动子转录，在正常情况下，该启动子是控制小核 RNA (small nuclear RNA，snRNA )U6 或者 RN

7、aseP 的组分 H1 RNA 转录的。另外一种办法是两段短 RNA 分子分别用 U6 启动子转录出来。载体介导的 siRNA 表达使对功能缺失 (loss-of-function)表型进行长期分析成为可能。在稳定转染的细胞内，两个月后仍可观察到沉默现象。另外一种延长 siRNA 抑制基因表达时间的方法是对化学合成的 RNA 进行核苷酸修饰。尽管未经修饰 的短双链 RNA 在细胞培养物或者体内的稳定性出乎意料的高，然而有些情况下，需要对 siRNA 的稳定性 进行进一步提高。 因此，可以在两条链的末端都引入经过修饰的核苷。 一个 5端为两个 2-O- 甲基 RNA 、 3 端为 4 个甲基化核

8、苷的 siRNA 与序列相同但是未经修饰的 siRNA 比活性相同， 但是在细胞培养物中引 起的基因沉默现象的时间延长。然而，增多 siRNA 中的甲基化核苷，或者在核苷中引入体积较大的烯丙基 将导致 siRNA 活性下降。RNA 干扰在哺乳动物体内的第一个研究是利用快速注射大量生理溶液的方法将一个编码 shRNA 的质 粒注入老鼠的尾静脉。在大多数器官中，报道基因(编码于共转染质粒或者转基因小鼠上)的表达可以被 有效地抑制。 另外， Fas 基因被作为肝损伤治疗相关的内源靶标进行了 RNA 干扰实验。注射 siRNA 之后， 小鼠肝细胞中的 Fas mRNA 和蛋白水平下降了 10 天。把

9、Fas 基因沉默可以保护小鼠免遭由注射竞争性 Fas 特异抗体引起的爆发性肝炎， 82% 用 siRNA 处理的小鼠活过了 10 天观察期， 而所有的对照小鼠在 3 天之内死亡。上述研究中采用的高压导入技术是一种粗暴的方法，不适于治疗用。因此，标准的基因治疗所采用的 方法被用于 RNA 干扰。一个反转录病毒载体被用于导入 siRNA ，以抑制人类胰腺肿瘤细胞中的癌基因 K-ras 等位基因。负调控癌细胞中 K-ras 基因的表达使得它们在注入无胸腺的裸鼠皮下之后不再具有形成 肿瘤的能力。这项研究还表明 siRNA 的高度特异性，因为只有癌基因 K-ras 被沉默，而与之只有 1 个碱 基对差异

10、的野生型等位基因并没有被沉默。另外，当在纹状区注射表达 siRNA 的腺病毒之后，转基因小鼠 大脑中GFP基因的表达可以被抑制。B葡萄糖醛酸苷酶(b-glucoronidase )的活性可以通过在小鼠尾静脉注射重组腺病毒抑制。有趣的是，具有 CMV 启动子和最小的 polyA 尾的 RNA 聚合酶 II 表达元件被 用于这个实验，为设计组织特异性或者可诱导的 siRNA 载体打开了大门。总的来说，siRNA的第一个体内实验已经进行，其他有重要意义的基因有望于很快作为靶标开展研究。 至今为止的研究没有观察到任何应用 siRNA 引起的毒性作用， 但是在治疗人类疾病的临床试验开始之前仍 需小心，以

11、排除长期使用 RNA 干扰引起的严重副作用。因为用 siRNA 使基因表达沉默与传统的反义技术 相似，研究者将从十多年来反义技术研究的教训中获益，比如需要使用合适的对照以证明基因表达的敲除 是特异性的，以及对免疫系统可能引起的意外影响进行详细分析。经过长期盛衰沉浮，反义技术近年来得到越来越多的注意。对能够提高靶表亲和性和生物稳定性、降 低毒性的修饰核苷的研究取得了重要进展。由于大多数新的 DNA 类似物不能激活 RNaseH ，对反义寡核 苷酸的设计需要考虑靶 mRNA 是否需要保留，例如，是改变剪接方式，还是降解靶 mRNA (这种情况下 应该使用 gapmer 技术)。可以通过有系统的修饰

12、天然核酶或者通过体外选择技术获得具有高催化活性的 稳定核酶。一些反义寡核苷酸和核酶已经进入临床试验研究，一个反义药物已经在1998 年获得批准。一个重要的突破是发现短的双链 RNA 分子可用于哺乳动物细胞中特异性沉默基因表达。 这个方法与传统的反 义技术比效率明显更高，并且一些体内实验的数据已经发表。因此，反义技术有望广泛应用于对未知功能 基因的研究、药物靶标的确认和治疗。RNAi 的发现RNA 干扰( RNAinterference，RNAi )现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。将与靶基因的转录产物 mRNA 存在同源互补序列的双链 RNA (doublestrand

13、RNA， dsRNA )导入细胞后，能特异性地降解该 mRNA ，从而产生相应的功能表型缺失，这一过程属于转录后基因沉默机制 ( posttranscriptionalgenesiliencing ， PTGS )范畴。 RNAi 广泛存在于生物界，从低等原核生物，到 植物，真菌，无脊椎动物，甚至近来在哺乳动物中也发现了此种现象，只是机制也更为复杂。早在 1990 年进行转基因植物有关研究时偶然发现，将全长或部分基因导入植物细胞后某些内源性基因不 能表达，但这些基因的转录并无任何影响，并将这种现象称为基因转录后沉默 (posttranscriptionalgenesilencing， PTGS

14、 ).1996 年在脉孢菌属( Neurospora )中发现了相似现象，只不过将这种现象命名为基因表达的阻抑作用( quelling ) .首次发现 dsRNA 能够导致基因沉默的线 索来源于线虫 Caenorhabditiselegans 的研究。 1995 年康乃尔大学的研究人员 Guo 和 Kemphues 尝 试用反义 RNA 去阻断 par 1 基因的表达以探讨该基因的功能， 结果反义 RNA 的确能够阻断 par21 基因 的表达，但是奇怪的是，注入正义链 RNA 作为对照，也同样阻断了基因的表达。这个奇怪的现象直到 3 年后才被解开 华盛顿卡耐基研究院的 AndrewFire

15、和马萨诸塞大学癌症中心的 CraigMello 首次将双 链 dsRNA 正义链和反义链的混合物注入线虫， 结果诱发了比单独注射正义链或者反义链都要强得多的 基因沉默。 实际上每个细胞只要很少几个分子的双链 RNA 已经足够完全阻断同源基因的表达。 后来的实验 表明在线虫中注入双链 RNA 不单可以阻断整个线虫的同源基因表达， 还会导致其第一代子代的同源基因沉 默。他们将这种现象称为 RNA 干扰。过去认为，哺乳动物细胞中不存在 RNAi 现象，因为较长的 dsRNA 在哺乳动物细胞中能诱导 IFN (干扰 素)生成，并激活 STAT 途径参与的 PKR ( dsRNA 依赖性激酶)的转录，同

16、时 dsRNA 本身与 PKR 结合 也能令其激活，继而磷酸化翻译起始因子 eIF2a 使之失活，导致非特异性的蛋白质合成障碍；另一方面， dsRNA又能诱导细胞产生多种抗病毒蛋白的2 ',5 '腺苷合成酶，生成2 ',5 '腺苷酸，激活非特异性的RNA酶 L 发生非特异性的 RNA 降解效应。现在发现 只要 dsRNA 短于 30bp 就不会促发干扰素效应 同 时又能特异性地降解 mRNA 引起基因沉默 说明 dsRNA 在哺乳动物细胞中也能发挥一定作用 为以后 的基因治疗等 RNAi 应用领域提供了新的研究方向。RNAi的详细机制和过程还不十分清楚,目前大致

17、分为以下几个阶段进行：siRNA的形成阶段：此阶段需要 Rde-1,Rde-4 和 dsRNA 特异性的核酸内切酶 Dicer 等共同参与。 Rde-1,4 编码的蛋白识别外源 dsRNA ，引导 dsRNA 与 Dicer 结合，然后， Dicer 将 dsRNA 解旋，再将其裂解为 21-25 nt 大小的小干 扰 RNA ( small interfering RNA，siRNA )。 Dicer 定位于胞浆中，但核内 mRNA 剪切修饰后在向核外运输过程中也存在 RNAi 现象，可能有其他类似功能的酶发挥作用。现认为 21-25nt 大小并在 3'端带有 2-3 个碱基悬端且

18、5'端磷酸化的 siRNA 诱导的 RNAi 效应最强。 Dicer 家族在进化上非常保守， 有5个组 成部分： N- 端 RNA 解旋酶结构域、 1 个 PAZ 结构域( Piwi ，augonaute ，Zwille/pinehead，PAZ)、2 个 RNaseIII 结构域和 C 端 dsRNA 结合基序。 Dicer 在体内一般是以二聚体的形式发挥作用的，由于 不同种族Dicer分子大小不一样，所以 dsRNA被切割成的siRNA大小具有种族差异。RNA诱导的沉默复合物( RNA-induced silicencing complex， RISC )形成阶段：生成的 siRN

19、A 和 RNAi 特异性酶如AGO-2 、MUT-7 、RED-1 、PAZ 蛋白和 DNA-RNA 螺旋酶结合形成 RISC ，具有序列特异性核酸内切酶、 核酸外切酶和解旋酶活性，能特异地降解与 siRNA 同源的靶 mRNA 。效应阶段： siRNA 引导 RISC 与 同源性的 mRNA 结合，在 ATP 及解旋酶(如 qde-3 ， mut-6 ， mut-14 )的作用下使 siRNA 链解离，并使 RISC 由 250kD 大小的前体形式变成约 100kD 左右活性形式， 同时解旋酶催化同源 mRNA 与 siRNA 的正义链相互交换，核酸酶在mRNA与反义RNA所形成的双链区的5

20、'起始端下游7-10个核苷酸处切断 mRNA ，起到特异的抑制基因表达的效果。 扩增阶段： 该反应以 siRNA 中的一条链为引物， 以靶 mRNA 为摸板，在 RNA 依赖的 RNA 聚合酶( RNA-dependent RNA polymerase， RdRP )作用下，扩增靶mRNA，产生新的二级siRNA，而这些siRNA又能继续反作用于靶 mRNA。RdRP不仅能增加siRNA的 拷贝数，而且能将异常的单链 RNA转变dsRNA。RdRP还是一个重要的“sensor”，它能识别正常和异常 的 RNA 。转基因 RNA 和病毒 RNA 都是在 RdRP 的识别下启动 RNAi

21、的反应过程。此外， RNAi 的扩增效 应还可能存在另外两种机制： Dicer将长dsRNA切成初级siRNA，这一放大水平取决于 dsRNA的长 度；siRNA在酶的作用下可以多次应用，产生进一步的放大效应。RNAi 的作用机制干扰性小 RNA( smallinterferingRNA ，或 shortinterferingRNAs ， siRNA )是 RNA 干扰作用( RNAi ) 赖以发生的重要中间效应分子.siRNA是一类长约2125个核苷酸(nt )的特殊双链RNA ( dsRNA )分子，具有特征性结构，即 siRNA 的序列与所作用的靶 mRNA 序列具有同源性； siRNA

22、 两条单链末端为 5' 端磷酸和3'端羟基.此外，每条单链的3'端均有23个突出的非配对的碱基 RNAi的主要过程是，dsRNA 被核酸酶切割成2125nt的干扰性小RNA ( siRNA )，由siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA分子.细胞中 dsRNA 的形成是 RNAi 的第一步 .细胞中 dsRNA 可通过多种途径形成，如基因组中 DNA 反 向重复序列的转录产物；同时转录反义和正义 RNA ;病毒RNA复制中间体；以及以细胞中单链 RNA为模 板由细胞或病毒的 RNA 依赖 RNA 聚合酶( RdRp )催化合成 dsRNA 等. 在线虫( C.ele

23、gans )可以直接 注射 dsRNA 或把线虫浸泡在含 dsRNA 溶液中等方式引入外源 dsRNA ，还可以通过喂养表达正义和反义 RNA 的细菌获得 dsRNA.现已初步阐明RNAi的作用机制.RNAi的第一步是，dsRNA在内切核酸酶(一种具有 RNase山样活性的 核酸酶)作用下加工裂解形成 2125nt的由正义和反义序列组成的干扰性小dsRNA，即siRNA.果蝇中RNaseIII 样核酸酶称为 Dicer.Dicer 含有解旋酶( helicase )活性以及 dsRNA 结合域和 PAZ 结构域 .已发现在 Arabidopsis ， C.elegans ， Schizosac

24、charomycespombe 以及哺乳动物中也存在 Dicer 同类 物.RNAi的第二步是，由siRNA中的反义链指导形成一种核蛋白体，该核蛋白体称为RNA诱导的沉默复合体( RNAinducedsilencingcomplex ， RISC )，由 RISC 介导切割靶 mRNA 分子中与 siRNA 反义链 互补的区域，从而达到干扰基因表达作用 .RISC 由多种蛋白成分组成，包括内切核酸酶、外切核酸酶、解 旋酶和同源 RNA 链搜索活性等 .线虫 C.elegans 中的 MUT7 (一种 RNaseD 样蛋白)可能是一种 3' 5'外 切核酸酶 .此外， PAZPP

25、iwi 蛋白家族成员可能是 RISC 中的构成组分，如 Arabidposis 中的 AGO1 ； N.Crassa 中的 QDE； C.elegans 中的 RDE1 等，以上这些蛋白与翻译因子 eIF2C 同源. 研究进一步揭示， ATP 在 siRNA 介导的 RNAi 中具有重要作用 .较长 dsRNA 向 siRNA 的转变要有 ATP 参 与.siRNA与蛋白因子形成一个无活性的约360kD的蛋白PRNA复合体；随之，siRNA双链结构解旋并形成有活性的蛋白 PRNA 复合体( RISC )，此步具有 ATP 依赖性 .RISC 活性复合体对靶 mRNA 的识别 和切割作用，这一步

26、可能不需 ATP 参与.此外， ATP 使 siRNA5' 端带上磷酸分子， 且对 siRNA 的功能具有重要作用 .上述过程中 siRNA 双链结构解 旋很可能是一种稳定的结构改变，因为 siRNA 双链体与细胞裂解物、 ATP 等孵育后再除去 ATP 及其它辅 助因子，含有 siRNA 的活性复合体仍能识别和切割靶 mRNA 分子siRNA 可作为一种特殊引物， 在 RNA 依赖 RNA 聚合酶 （RdRp ）作用下以靶 mRNA 为模板合成 dsRNA ， 后者可被降解形成新的 siRNA ；新生成的 siRNA 又可进入上述循环 . 这种过程称为随机降解性多聚酶链反 应（ran

27、domdegradativePCR ）.新生的dsRNA 反复合成和降解，不断产生新的siRNA，从而使靶 mRNA 渐进性减少，呈现基因沉默现象 .RdRp 一般只对所表达的靶 mRNA 发挥作用，这种在 RNAi 过程中对靶 mRNA 的特异性扩增作用有助于增强 RNAi 的特异性基因监视功能 .每个细胞只需要少量 dsRNA 即能完全 关闭相应基因表达，可见 RNAi 过程具有生物催化反应的基本动力学特征 .miRNA 与 siRNA 的区别：（1 ） miRNA 是单链的，而 siRNA 则是双链的；（2 ） miRNA 参与正常情况下生长发育基因调控，而 siRNA 不参与动物体的正

28、常生长，只有在病毒或其它 dsRNA 诱导情况下才产生 siRNA ，作为 miRNA 的完善和补充；（ 3 ） miRNA 在转录后水平调节基因表达，推测在翻译水平也起作用，而 siRNA 为转录后水平调节基因 表达调控；（4 ） Dicer 酶对两类 RNA 的加工过程， miRNA 为不对称性，仅来自含茎环结构 RNA 前体的一侧臂， 剩余部分很快降解，而这种不对称性不存在于而 siRNA 加工过程中。RNAi 的特点 高度特异性：有时siRNA 一个碱基改变就会大大降低封闭靶基因的效果。Brummelkamp4 等利用载体表达的小发夹 RNA （small hairpin RNA ，

29、shRNA ）来封闭人 MCF-7 细胞的 CDH1 基因， shRNA 上仅一对碱基的突变就不能抑制CDH1基因的表达。其中siRNA的中央位置碱基位点和 3'末端倒数第二个碱基起了格外重要的作用。 高效率：在细胞内 RNAi途径一旦被启动，反应信号就被放大。在低等动物中靶基因表达抑制效率大于90% ，甚至有人认为每个细胞一份拷贝的 dsRNA 就可以封闭基因的效果。 高成功率： RNAi 已被用于线虫全基因组的功能分析，其中有 50%-80% 序列选择有效， 12.9%-27% 的基因封闭产生了明显的异常表型。 种属时 -效性： Irie 等人发现，在低等生物中 RNAi 可持续存

30、在，但 RNAi 在哺乳动物细胞中只能维持一 段时间，一般注入 dsRNA 后的 2-3 天， RNAi 的作用最明显，尔后 1-2 天内，靶 mRNA 的丰度就能恢复 到注射 RNAi 之前的水平。这可能是由于 RNA 依赖的核苷脱氨酶脱氨基活性的逐步增高导致 siRNA 的生 成减少而受到抑制。 dsRNA的长度限制性：引发有效RNAi的dsRNA最短不得短于21nt , Dicer能与200-500nt 范围内的dsRNA结合，底物片段越短，Dicer酶的活性也就越弱，提示 RNAi具有dsRNA片段长度限制性。RNAi的遗传性：1998年Fire等就发现在线虫中 RNAi可以传代，以后

31、Worby等人在果蝇的培养细胞中 也发现了类似的现象。线虫中的RNAi遗传性需要R de-1和R de-2来启动。 传播性： RNAi 效应可以在细胞间扩散， dsRNA 可在果蝇细胞群落之间传播，在线虫局部注射 dsRNA 也可传播到整个机体。 Van 等研究发现 sid-1 基因编码一种具有十一次跨膜蛋白可能与此现象有关。 ATP依赖性：在去除 ATP的样品中RNAi现象降低或消失，显示 RNAi是一个ATP依赖的过程，可能 与Dicer和RISC的酶切反应必须由 ATP提供能量有关。模板选择性： RNAi只有效作用于外显子，而 对内含子无影响。 dsRNA 序列是某个基因的启动子序列时也

32、没有明显的效应。另外， RNAi 对稳定并丰富 表达的靶基因抑制效率也不高。RNAi 的生物学意义及其应用RNAi 的生物学意义主要是维持基因组稳定、抑制转基因表达和保护基因组免受外源核酸侵入。研究证实RNAi 缺陷可引起内源性转座子的移动。转座子沉默与 DNA 甲基化、 H3mK9 ( histone H3 lysine-9 methylation )和 RNAi 有关，大多数转座子沉默与 met1 ( DNA methyltransferase)、ddm1 (decreasein DNA methylation 1)和 sil1 ( Streptomyces subtilisin inhi

33、bitor-like 1)有关，而很少的转座子沉默需要 KRYPTONINE (H3K9 methyltransferase)、 ARGONAUTE1 (RNAi gene )和CHROMOMETHYLASE3 ( CXG methyltrasferase)。 Hall 等研究表明，着丝粒同源重复序列和RNAi组分一起正负调节着异染色质的形成并且共同促使异染色质组装成核。最近研究发现， RNAi 需要的一种 AGO 蛋白 TbAGO2 与细胞有丝分裂和染色体分离有关。 dsRNA 还出现在许多病毒 (包括单链 RNA 病毒) 感染的细胞内，诱发 RNAi 而封闭病毒生存和繁殖所必需的基因或激发

34、干扰素诱导的抗病毒效应。 RNAi 还可能在胚胎发育过程中具有重要功能，也可能参与了生物体正常的基因表达调控，同时与基因印迹也有 关。RNAi 是一种高效的特异性强的基因阻断技术，近年来发展迅速，很快就成为功能基因组研究的有力工具。 通过实验手段将 dsRNA 分子导入细胞内，特异性地降解细胞内与其序列同源的 mRNA ，封闭内源性基因 表达，从反向遗传的角度研究人类或其他生物基因组中未知基因的功能。早期就有人应用此项技术分离了 果蝇胰岛素信号转导途径通路中的各种成分。近来也有实验报道通过 RNAi 研究细胞内脂质平衡过程中涉 及的各条途径。在这之前，曾利用反义 RNA 与靶 mRNA 序列互

35、补的特性来抑制其表型的发生，但由于反 义 RNA 对内源性表达的基因抑制作用较弱， 往往会产生一些过渡表型， 易造成对基因功能判断错误， 目前 已通过审批认为临床上具有治疗作用的仅有一种药物 Vitravene 。RNAi技术与之相比，特异性更高，作用更迅速，副反应小，在有效地沉默靶基因的同时，对细胞本身的调控系统也没有影响。最近在人类体 细胞里已经成功地对近 20 种基因功能进行了 “敲除”，尤其是因此而了解了人类空泡蛋白 Tsg101 对 HIV 在人体内增殖的作用，进一步深化了对 HIV 的研究。 Leonid 等以脊髓灰质炎病毒为模型，利用 RNAi 来 诱导细胞的胞内免疫， 产生抗病

36、毒效应， 尤其是针对 RNA 病毒。 对于易突变的病毒， 可设计多种靶向病毒 基因保守序列的 dsRNA ，减少它对 dsRNA 的抵抗。 Maen 等也应用 RNAi 技术成功地阻断了 MCF 7 乳 腺癌细胞中一种异常表达的与细胞增殖分化相关的核转录因子基因 Sp21 的功能。 RNAi 技术的应用，不 仅能大大推动人类后基因组计划(蛋白组学)的发展，还有可能设计出RNAi 芯片，高通量地筛选药物靶基因，逐条检测人类基因组的表达抑制情况来明确基因的功能，并且它还将应用于基因治疗、新药开发、 生物医学研究等领域，用 RNAi 技术来抑制基因的异常表达，为治疗癌症、遗传病等疾病开辟了新的途径。

37、 具体可用于以下几个方面：1 基因功能分析 基因敲除技术需要较长时间去永久性的关闭某个基因的表达，而RNAi 技术则可在一周内、甚至 2 天内可控性的关闭 10 个基因。 RNAi 技术还具有一个优势，能同时封闭多个基因或基因家族，用于研究 mRNA 差别剪接形成的异构体，甚至在基因组水平上构建针对基因组的RNAi 表达载体，用于研究基因之间的相互作用和进行基因功能的高通量筛查。使用 RNAi 技术在那些低等生物中基因组功能测定都已基本结束。在哺乳动物和人类基因的功能研究中，Harborth 等利用脂质体及质粒分别将编码核纤层蛋白B1或B2、NUP153、GAS41、ARC21、胞质动力蛋白、

38、蛋白激酶cdkl、B或丫肌动蛋白以及非必须结构基因 emerin 和 zyxin 的 siRNA 转染到 Hela 、 SS6 细胞和大鼠 F5 、 FR 成纤维细胞内，结果发现上述基因的功能表现 与以往使用基因剔除法获得的信息一致。 Sui 等应用 DNA 载体体外构建目的基因的 siRNA ，包括外源绿 色荧光蛋白、 内源 Lamin-A 、 Lamin-C 、 cdk-2 和 dnmt-1 基因， 转染 Hela 、 H1229 、 C-33A 、 U-2OS 细胞，结果显示 siRNA 对目的基因的抑制作用均在 86% 以上。2 研究信号传导通路的新途径联合利用传统的缺失突变技术， R

39、NAi 技术可以很容易地确定复杂的信号传导途径中不同基因的上下游关 系， Clemens 等应用 RNAi 研究了果蝇细胞系中胰岛素信息传导途径， 取得了与已知胰岛素信息传导通路 完全一致的结果， 在此基础上分析了 DSH3PX1(Dock src homology 3 phox 1)与 DACK(Drosophilaactivated Cdc42 tyrosine kinase)之间的关系，证实了 DACK 是位于 DSH3PX1 磷酸化的上游激酶。3 新药物的研究和开发RNAi 还可以作为寻找新的药物靶标的工具，可以高通量地发现药物靶基因，帮助新药物的研究和开发， 了解药物作用的生化模式等

40、。 Makimura 等利用 RNAi 技术减少了丘脑下部 AGRP (agouti-releted peptide )50% 的表达量， AGRP 使代谢率提高而不减少摄食量，从而减轻肥胖，为肥胖的治疗提供了一 个靶点。美国 Genetica 公司已将 RNAi 技术作为高通量药物靶标识别和确认的工具。4 基因治疗RNAi 只抑制致病基因，而不影响正常等位基因的功能，具有较高的选择性和特异性，能减少非特异作用 引起的副作用。4.1 治疗病毒感染可将 RNAi 视为一种与免疫系统类似的防御机制，利用 RNAi 技术进行病毒感染的干扰实验已在植物及低 等生物中取得满意的结果，但在人体细胞内的实验

41、才刚刚起步。已有研究表明，用siRNA 抑制 HIV 的某些基因，如 p24 、 vif 、 nef 、 tat 或 rev 可阻碍 HIV 在细胞内复制；抑制 HIV 的受体 CD4 和 CD8a 或辅 助受体 CXCR4 或 CCR5 或病毒结构 Gag 蛋白表达可阻碍 HIV 感染细胞。 所以应用 siRNA 可能成为防止 HIV-1 感染的一种有效手段。 Hamasaki 等构建的 siRNA 特异性表达载体与 HBV 病毒 DNA 共转染人肝 癌细胞 HuH7 和 HepG2 ，降低了 RNA 及其复制中间体的水平， 并引起 HBeAg 分泌的下降。 最近， Song 等通过 RNA

42、i 技术使 Fas 基因沉默，成功地在自身免疫性肝炎小鼠模型中预防了肝衰竭和肝纤维化。4.2 治疗肿瘤 肿瘤发生是多基因相互作用的基因网络调控的结果，传统技术诱发的单一癌基因的阻断不可能完全抑制或 逆转肿瘤的生长，而 RNAi 可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性， 设计针对这一区段序列的 dsRNA 分子， 只注射一种 dsRNA 即可以产生多个基因同时沉默的效应， 也可以 同时注射多种 dsRNA 而将多个序列不相关的基因同时沉默。 Cioca 等利用粒细胞白血病细胞系研究了 Raf-1 和 bcl-2 基因在白血病中的作用，表明 RNAi 能诱导细胞凋亡并能

43、提高肿瘤细胞对化学治疗的敏感性。Zhang 等将针对鼠源 VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor)各亚型基因的 siRNA 构建成的RNAi表达载体，均特异性抑制了各亚型 VEGF的表达，有效的抑制了肿瘤细胞的生长。性连环蛋白和APC 基因是 Wnt 信号通路中的重要组分， 突变后引起细胞异常增殖， 在肿瘤的发生中起重要作用。 Verma 等利用 RNAi 技术使这两个基因表达降低，在细胞和裸鼠中都能抑制肿瘤细胞的增殖。以erbB1 、端粒酶 为靶点，利用 RNAi 技术抑制肿瘤的研究也取得了满意结果。5 其它应用RNAi 还可用于细胞周期调控、代谢、

44、膜转运以及 DNA 损伤反应、转录或甲基化等多种方面的基因功能研究。最新研究发现，用 RNAi技术阻断N rdpl （为ErbB3成员）、BRUCE （为一个530kDa的膜相关凋 亡蛋白抑制因子）、 Chk1 、 Wee1 和 Myt1 等进一步解释了细胞凋亡的机制，其中 BRUCE 通常可抑制凋 亡，而N rdpl在凋亡初始阶段起到特别重要的作用。RNAi 相关术语1. RNAi ：（ RNA interference ） RNA 干扰一些小的双链 RNA 可以高效、特异的阻断体内特定基因表达，促使 mRNA 降解，诱使细胞表现出特定基 因缺失的表型，称为 RNA 干扰（ RNA inte

45、rference ， RNAi ，也译作 RNA 干预或者干涉）。它也是体 内抵御外在感染的一种重要保护机制。2. siRNA ：（ small interfering RNAs ）小干扰 RNA一种短片断双链 RNA 分子，能够以同源互补序列的 mRNA 为靶目标降解特定的 mRNA ，这个过程就是 RNA 干扰途径（ RNA interference pathway ）。3. shRNAsRNA-Short hairpin RNAs）短发夹 RNA是设计为能够形成发夹结构的非编码小 RNA 分子，短发夹 RNA 能够通过 RNA 干扰来抑制基因的表达。 Thomas Rosenquists

46、 group 和 Greg Hannon s group 联合研究了在哺乳动物种系细胞中 shRNAs的转移导致基因长时间稳定沉默的机制。4. bpBase Pair ）碱基对两个碱基（A和T,或者C和G）之间靠氢键结合在一起，形成一个碱基对。DNA的两条链就是靠碱基对之间的氢键连接在一起，形成双螺旋结构。5. Base sequence:碱基序列DNA 分子中碱基的排列顺序。6. Base Sequence Analysis:碱基序列分析分析出 DNA 分子中碱基序列的方法（这种方法有时能够全自动化）cDNA ：参见互补 DNA 。7. cDNA ：互补 DNA以信使 RNA 为模板合成的

47、DNA ，常常采用互补 DNA 的一条链作为绘制物理图谱时的探针。8. Complementary sequence：互补序列以一条核苷酸链为模板，根据碱基互补规则形成的互补链，称为该模板的互补序列。9. Genomic Library ：基因组文库 对某个染色体，制备随机产生的、相互之间有重叠部分的片段的克隆。10. RISC ：( RNA-induced silencing complex) RNA 诱导沉默复合物在 RNAi 效应阶段， siRNA 双链结合一个核酶复合物从而形成所谓 RNA 诱导沉默复合物。激活 RISC 需 要一个 ATP 依赖的将 siRNA 解双链的过程。 激活的

48、 RISC 通过碱基配对定位到同源 mRNA 转录本上， 并 在距离 siRNA3 端 12 个碱基的位置切割 mRNA (3, 18, 27, 29 )。尽管切割的精确机制现在还是未知， 研究表明每个 RISC 都包含一个 siRNA 和一个不同于 Dicer 的 RNA 酶。11. Dicer ： Dicer 酶RNaseIII 家族中特异识别双链 RNA 的一员，能以一种 ATP 依赖的方式逐步( processive )切割由外源 导入或者由转基因、病毒感染等各种方式引入的双链 RNA ，切割将 RNA 降解为 19 21bp 的双链 RNAs (siRNAs )，每个片断的 3端都有

49、 2 个碱基突出( 27, 28 )。12. PTGS ：( Post-transcriptional Gene Silencing ,PTGS)转录后基因沉默部分的植物中的基因沉默是在转录后发生的。它是相对于部分植物中发生的转录阶段的基因沉默( TGS ) 而言的。13. TGS ：( transcriptional gene silencing)转录阶段基因沉默14. gene silence: 基因沉默研究结果发现有大量的转基因植株不能正常表达，通常这并不是由于转基因的缺失或突变引起的，而是基 因失活的结果 .这种失活的现象称为基因沉默。15. RNA transfection ： RN

50、A 转染。16.Sense RNA ：正义链 RNA17.Antisense RNA ：反义链 RNA 。18.19 2 2 nt siRNA ：在细胞中双链 RNA 一般都被切割成 21-23 小片段，这样的 RNA 片段能达到更好的 RNAi 作用。人工合 成的 siRNA 也是依据这个原理， 所合成的 RNA 就是 19nt 的碱基序列再加上两端的识别序列如 -GG ，-TT 等。19.SECssiRNA expression cassettes) siRNA 表达框架一种由 PCR 得到的 siRNA 表达模版，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。20.Homologies

51、 ：同源性指同种类不同个体或者不同种类个体之间的，染色体或者蛋白质序列的相似性一对染色体，分别来自父本和母本，染色体上有着相同的线性基因序列。22. Recombinant Clone：重组克隆将不同来源的 DNA 片段合成在一个 DNA 分子中，这种技术称为重组，得到的分子为重组克隆。23. Ribonucleic acid ：核糖核酸 RNA 从细胞的细胞核和细胞质部分分离出来的化学物质。在蛋白质合成和其他生化反应中起着重要作用， RNA 的结构和 DNA 的结构类似，都是有核苷酸按照一定顺序排列成的长链。 RNA 可以分为信使 RNA 、转运 RNA 、核糖体 RNA 以及其他类型的 R

52、NA 。24. rRNA ：（ RNARibonsomal RNA ，核糖体）存在于核糖体中的 RNA 。25. Ribonsome ：核糖体细胞质中含有 rRNA 和相关蛋白质的细胞器，是蛋白质的合成场所。26. Transformation ：转化将外源 DNA 整合到某一细胞基因组中的过程。27. Entrez ：美国国家生物技术信息中心所提供的在线资源检索器。该资源将 GenBank 序列与其原始文献出处链接在 一起。28. NCBI ：（ National Center for Biotechnology Information）美国国立生物技术信息中心为美国国家医学图书馆（ NLM

53、 ）和国家健康协会（ NIH ）下属部门之一， 1988 年设立。主要提供生物医 学领域的信息学服务， 如世界三大核酸数据库之一的 GenBank 数据库， PubMed 医学文献检索数据库等。29. GenBank ： NIH 的基因序列数据库是所有公开的 DNA 序列的集合 （ Nucleic Acids Research 1998 Jan 1;26（1 ） :1-7 ）. 截至 1998年 12 月， GenBank 大约收集了 2,162,000,000 个碱基、 3,044,000 个序列。30. Ribosomal RNA ：（核糖体 RNA ，简写为 rRNA ） 是一组存在于核

54、糖体中的 RNA 分子。31. UniGene美国国家生物技术信息中心提供的公用数据库，该数据库将 GenBank中属于同一条基因的所有片断拼接 成完整的基因进行收录。32. BLAST: ( Basic Local Alignment Search Tool)基本的基于局部对准的搜索工具一种快速查找与给定序列具有连续相同片断的序列的技术。是一个序列比对Alignment 应用程序。它可以在线选择服务器上的数据库进行序列比较包括 DNA/DNARNA/DNA蛋白/蛋白序列比对序列比对的作用很多如同源核酸或蛋白序列的查找引物或探针特异性分析物种进化树的构建等等目前多数网站和软件均提 供免费的BL

55、AST的本地或在线检索比较著名的提供序列比对服务有NCBI的BLAST检索如果需要详细了解这个程序可到 GEJ "去具体看一看帮助文件但是上NCBI需要国际代理国内的朋友可通过上海生科院的生物信息中心进行BLAST网址ZEI:8888/blast/130 速度不错33. RT-PCR:逆转录 PCRRT-PCR是以RNA为起始材料经逆转录反应产生cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获取目的基因或检测基因表达。34. DNA 印迹杂交：(DNA blot hybridization )有两种核酸印迹法：?将DNA或RNA溶液直

56、接点样于硝酸纤维素膜或尼农膜上(斑点或狭线印迹)?经琼脂糖凝胶电泳将片段的DNA或RNA转移到膜上(Southern 和Northern 印迹法)。DNA在电泳前先用限制性内切酶消化。35. RNA 印迹杂交：(RNA blot hybridization )RNA印迹杂交是一种检测已固定在滤膜上的总RNA或mRNA特定靶序列的技术。36. RNA酶控制：在实验中前期的质粒的构建和提取是要用到RNAse A这种酶的存在会降解后期要转录生产的RNA如果前期出现了这个酶的污染就会导致后期实验的失败，而后期转录是又要用到其他的RNA酶，如RNA聚合酶3等，因此在实验中严格控制好RNA酶是RNA实验的

57、关键，具体的做法是做到DNA，RNA移液器的专用，DNA实验室和RNA实验室的物品和器械分开使用，将实验室中的任务污染源减少至最低。RNAi技术关键问题低等生物对dsRNA或siRNA导入的条件要求较低，成功率较高，但对较高级的哺乳动物和人类细胞株的 转染成功率却不理想。哺乳动物的细胞对dsRNA的导入具有抗拒性，并且值得注意的是大于30bp的dsRNA导入哺乳动物细胞可诱导干扰素的合成结果是非特异性的和全面的抑制基因表达，最终导致细胞凋亡；同时dsRNA具有浓度依赖性，dsRNA诱发的RNAi效应的强度随着其浓度的增高而增强，但是浓度 过高RNAi效应也会降低等。RNAi在哺乳动物中的实验遇

58、到的另一问题是RNAi衰减现象，siRNA被导入细胞后RNAi效应仅持续数天便逐渐消失。此外RNAi技术和反义RNA技术一样，有一些如寡聚核酸合成困难、易被降解、导入困难等相似的缺点。（1 ） dsRNA序列的选择dsRNA主要选自已知的cDNA的开放阅读框架（ORF）中的基因区域。为防止 mRNA调控蛋白对RISC与靶RNA结合的干扰，应避免选择包括:1）起始密码子下游或终止密码的50100核苷酸位置以内的区域；2 ） 5 '或3 '端的非翻译区域；3 ）内含子区域。此外，序列选择时也应避开 多聚鸟苷酸序列区（3个），因为这样容易形成四聚体结构，抑制RNAi作用。选择与靶 mRNA上序列互补的2123个核苷酸长度的片段，以 AA开头为佳，因为此法能简化dsRNA合成过程，降低成本，而且合成的 dsRNA 能更好地抵抗 RNA 酶的降解。另外，尽量使 dsRNA 序列中的 GC 含量接近