酶的生物合成法生产

1、 第二章第二章 内容总结内容总结11、细菌 2、放线菌 属原核单细胞生物，有球菌、杆菌和螺旋菌三类，属原核单细胞生物，有球菌、杆菌和螺旋菌三类，分革兰氏阳性菌和阴性菌。在发酵专业中常用的是杆菌，分革兰氏阳性菌和阴性菌。在发酵专业中常用的是杆菌，它易形成芽孢。它易形成芽孢。 属原核生物，菌落呈放射状，广泛存在于泥土中，属原核生物，菌落呈放射状，广泛存在于泥土中，最大经济价值是用来生产抗生素。最大经济价值是用来生产抗生素。3、霉菌 属真核生物，俗称丝状真菌。在发酵工业、农业、食品属真核生物，俗称丝状真菌。在发酵工业、农业、食品和皮革等方面有重要用途，但易引起工业原料、产品和农副和皮革等方面有重要用

2、途，但易引起工业原料、产品和农副产品的发霉变质。产品的发霉变质。4、酵母菌 属真核单细胞生物，主要生长在偏酸含糖量较高的属真核单细胞生物，主要生长在偏酸含糖量较高的环境中，酒精、饮料等生产中有重要用途。环境中，酒精、饮料等生产中有重要用途。2 微生物工业对菌种的要求微生物工业对菌种的要求 ： (1)廉价原料、生长迅速、目的产物产量高。廉价原料、生长迅速、目的产物产量高。 (2)易于控制培养条件，酶活性高；发酵周期较短。易于控制培养条件，酶活性高；发酵周期较短。 (3)抗杂菌和嗜菌体的能力强。抗杂菌和嗜菌体的能力强。 (4)菌种纯，不易变异和退化，不产生任何有害的生菌种纯，不易变异和退化，不产生

3、任何有害的生物活物质和毒素，保证安全生产。物活物质和毒素，保证安全生产。 3定方案：定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。采样：采样：有针对性地采集样品。增殖：增殖：人为地通过控制养分或培养条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。分离：分离：利用分离技术得到纯种。发酵性能测定：发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。新种分离与筛选的步骤（新种分离与筛选的步骤（P56）4富集方法富集方法1、添加特殊的营养物质2、调整培养基的酸碱性3、控制培养温度和热处

4、理4、添加抑制剂5产酶微生物优良菌种的选育产酶微生物优良菌种的选育一、诱变育种一、诱变育种 化学诱变化学诱变 物理诱变物理诱变二、基因育种二、基因育种出发菌株的选择处理菌悬液的制备诱变处理筛选保藏6第三章第三章 酶的生物合成与发酵生产酶的生物合成与发酵生产 提取分离法提取分离法 微生物细胞发酵产酶微生物细胞发酵产酶 酶的生产方法酶的生产方法 生物合成法生物合成法 植物细胞发酵产酶植物细胞发酵产酶 化学合成法化学合成法 动物细胞发酵产酶动物细胞发酵产酶 7微生物发酵产酶微生物发酵产酶n酶的发酵生产：经过预先设计，通过人工操酶的发酵生产：经过预先设计，通过人工操作，利用微生物的生命活动，获得所需的

5、酶作，利用微生物的生命活动，获得所需的酶的技术过程。的技术过程。大多数酶的生产采用发酵生产大多数酶的生产采用发酵生产原因：微生原因：微生物具有种类多、繁殖快、易培养、代谢能力物具有种类多、繁殖快、易培养、代谢能力强等特点强等特点8酶的发酵生产的方式：酶的发酵生产的方式：|固体培养发酵|液体深层发酵|固定化微生物细胞发酵|固定化微生物原生质体发酵9 第一节第一节 酶生物合成及调节酶生物合成及调节一、酶的生物合成一、酶的生物合成 遗传信息传递的中心法则遗传信息传递的中心法则 蛋白质蛋白质翻译翻译转录转录逆转录逆转录复制复制复制复制DNARNA 10（一）（一）RNARNA的生物合成的生物合成-转录

6、转录(transcription)(transcription) 定义定义 以以DNADNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在为模板，以核苷三磷酸为底物，在RNARNA聚合酶（转录酶）的作用下，生成聚合酶（转录酶）的作用下，生成RNARNA分子分子的过程。的过程。. .11T C G A G T A CA G C T C A T GC G A G U A CG C A URNA聚合酶聚合酶RNAPPi555533GTPUTPCTPATPUTPRNA在在DNA模板上的生物合成模板上的生物合成33335512编码链编码链（coding strand)模板链模板链（template strand）RNA

7、的转录过程的转录过程( (三步三步) )1.1.起始起始2.2.延长延长3.3.终止终止 13RNARNA合成过程合成过程起始起始双链双链DNA局部解开局部解开磷酸二酯磷酸二酯键形成键形成终止阶段终止阶段解链区到达解链区到达基因终点基因终点延长阶段延长阶段5 3 RNA 启动子（启动子（promotor) 终止子终止子(terminator)5 RNA聚合酶聚合酶 5 3 5 3 5 5 3 离开离开1415RNARNA合成过程合成过程前体加工前体加工 定义定义 以以mRNAmRNA为模板，以氨基酸为底物，在核为模板，以氨基酸为底物，在核糖体上通过各种糖体上通过各种tRNAtRNA、酶和辅助因

8、子的作用，、酶和辅助因子的作用，合成多肽链的过程。合成多肽链的过程。（二）蛋白质的生物合成（二）蛋白质的生物合成-翻译翻译(translation)(translation) 16 蛋白质的合成过程蛋白质的合成过程 （大肠杆菌）（大肠杆菌）v 氨基酸的活化氨基酸的活化v 肽链合成的起始肽链合成的起始v 肽链的延伸肽链的延伸v 肽链合成的终止与释放肽链合成的终止与释放17氨基酸的活化与转运氨基酸的活化与转运反应式：反应式：AA + tRNA + ATPAA + tRNA + ATP氨酰氨酰-tRNA-tRNA合成酶合成酶AA-tRNAAA-tRNA+AMP+PPi +AMP+PPi 对于对于E.

9、coliE.coli而言，肽链合成时的第一而言，肽链合成时的第一个氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（个氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（fMetfMet）。）。18AA + ATP + E AA + ATP + E E-AA-AMPE-AA-AMP+PPi +PPi E-AA-AMPE-AA-AMP+ tRNA + tRNA AA-tRNAAA-tRNA+AMP +AMP 在核糖体上合成多肽（三阶段）在核糖体上合成多肽（三阶段）1 1、起始阶段、起始阶段2 2、延伸阶段、延伸阶段3 3、终止阶段、终止阶段1920二、酶生物合成的调节二、酶生物合成的调节定义：定义：通过调节酶合成的量来控制微生物通过调节酶合成的量来

10、控制微生物代谢速度的调节机制，是在基因转录水平上代谢速度的调节机制，是在基因转录水平上进行的。进行的。意义：意义：通过阻止酶的过量合成，节约生物通过阻止酶的过量合成，节约生物合成的原料和能量。合成的原料和能量。21转录水平的调节转录水平的调节转录产物的加工调节转录产物的加工调节翻译水平的调节翻译水平的调节翻译产物的加工调节翻译产物的加工调节酶降解调节酶降解调节组成酶：组成酶：DNADNA酶，酶，RNARNA酶，酶， 糖酵解途径的酶糖酵解途径的酶调节酶：适应酶，调节酶：适应酶，- -半乳糖苷酶（诱半乳糖苷酶（诱导酶）导酶）酶的类型酶的类型酶合成的调节控制酶合成的调节控制22（一）酶合成调节的类型

11、（一）酶合成调节的类型 转录水平的调控包括诱导转录水平的调控包括诱导(induction)和阻遏和阻遏(repression)两种方式。两种方式。 凡能促进酶生物合成的现象，称为诱导，而能阻凡能促进酶生物合成的现象，称为诱导，而能阻碍酶生物合成的现象，称为阻遏。碍酶生物合成的现象，称为阻遏。1.诱导诱导(induction)：是酶促分解底物或产物诱使微生是酶促分解底物或产物诱使微生物细胞合成分解代谢途径中有关酶的过程。物细胞合成分解代谢途径中有关酶的过程。 微生物通过诱导作用而产生的酶称为微生物通过诱导作用而产生的酶称为诱导酶（诱导酶（为为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的酶类）。适应外来

12、底物或其结构类似物而临时合成的酶类）。 举例：举例：E.coli在含乳糖的培养基中合成在含乳糖的培养基中合成-半乳糖苷半乳糖苷酶和半乳糖苷渗透酶等。酶和半乳糖苷渗透酶等。 23诱导物诱导物(inducer)：底物或结构类似物，如：底物或结构类似物，如：异丙基异丙基- -D-硫代半乳糖苷（硫代半乳糖苷（IPTG，isopropylthiogalactoside）。）。 诱导作用的类型诱导作用的类型： 同时诱导同时诱导：诱导物加入后，微生物：诱导物加入后，微生物能同时诱导出几种酶的合成，主要存在能同时诱导出几种酶的合成，主要存在于短的代谢途径中。于短的代谢途径中。 顺序诱导顺序诱导：先合成能分解底

13、物的酶，：先合成能分解底物的酶，再合成分解各中间代谢物的酶达到对复再合成分解各中间代谢物的酶达到对复杂代谢途径的分段调节。杂代谢途径的分段调节。24组成酶（固有酶）组成酶（固有酶）：不依赖底物或底物结：不依赖底物或底物结构类似物的存在而合成的酶。如：构类似物的存在而合成的酶。如：EMP途途径的一些酶。径的一些酶。诱导酶：诱导酶：依赖于底物或底物结构类似物的依赖于底物或底物结构类似物的存在而合成的酶。如：乳糖酶。存在而合成的酶。如：乳糖酶。 （一）酶合成调节的类（一）酶合成调节的类型型-2252.阻遏（阻遏（repression）代谢过程中包括关键酶在内的代谢过程中包括关键酶在内的的合的合成的现

14、象，从而更彻底地控制和减少末端产物的合成的现象，从而更彻底地控制和减少末端产物的合成。成。阻遏作用的类型阻遏作用的类型：末端产物阻遏（末端产物阻遏（end-product repression）：由于）：由于终产物的过量积累而导致生物合成途径中酶合成的终产物的过量积累而导致生物合成途径中酶合成的阻遏的现象，常常发生在氨基酸、嘌呤和嘧啶等这阻遏的现象，常常发生在氨基酸、嘌呤和嘧啶等这些重要结构元件生物合成的时候。些重要结构元件生物合成的时候。例如过量的精氨酸阻遏了参与合成精氨酸的许多酶例如过量的精氨酸阻遏了参与合成精氨酸的许多酶的合成。的合成。26 分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏（cataboli

15、te repression）：）：当微生物在含有两种能够分解底物的培养基中当微生物在含有两种能够分解底物的培养基中生长时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢生长时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶的合成的现象。的底物的有关酶的合成的现象。n最早发现于大肠杆菌生长在含葡萄糖和乳糖的最早发现于大肠杆菌生长在含葡萄糖和乳糖的培养基时培养基时,故又称故又称葡萄糖效应葡萄糖效应。分解代谢物阻。分解代谢物阻遏导致出现遏导致出现“二次生长（二次生长（diauxic growth）”.n直接作用者是直接作用者是优先利用的碳源的中间代谢物优先利用的碳源的中间代谢物实质是：实质是：2719601960

16、年年JacobJacob和和MonodMonod提出的操纵子学说提出的操纵子学说调节基因：产生阻遏蛋白调节基因：产生阻遏蛋白启动基因启动基因操纵基因：与阻遏蛋白结合操纵基因：与阻遏蛋白结合结构基因：蛋白多肽链产物结构基因：蛋白多肽链产物操纵子操纵子1.RNA1.RNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点2.cAMP2.cAMP及其受体蛋白复合物（及其受体蛋白复合物（cAMP-cAMP-CRPCRP）结合位点）结合位点（二）操纵子学说（二）操纵子学说28基因操纵子调节系统示意图基因操纵子调节系统示意图 调节基因调节基因 启动基因启动基因 操纵基因操纵基因 结构基因结构基因 DNA 转录转录 （-） RN

17、A聚合酶聚合酶 （+） 转录转录 翻译翻译 mRNA 翻译翻译 阻遏蛋白阻遏蛋白 蛋白质蛋白质 诱导剂诱导剂 控制区控制区 信息区信息区操纵子操纵子29 调节基因调节基因(regulator gene)(regulator gene)： 可产生一种组成型调节蛋白可产生一种组成型调节蛋白(regulatory (regulatory protein) protein) （一种变构蛋白），通过与效应（一种变构蛋白），通过与效应物物(effector) (effector) （包括诱导物和辅阻遏物）（包括诱导物和辅阻遏物）的特异结合而发生变构作用，从而改变它与的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操

18、纵基因的结合力。操纵基因的结合力。 调节基因常位于调控区的上游。调节基因常位于调控区的上游。30RPOSD N AC RP-cA M P复 合 物C RP+cA M P cAMP-CRP复合物的作用示意图复合物的作用示意图 启动基因（启动基因（promotor genepromotor gene）（启动子）：）（启动子）： 有两个位点：有两个位点： （1 1）RNARNA聚合酶的结合位点聚合酶的结合位点（2 2）cAMP-CAPcAMP-CAP的结合位点。的结合位点。CAPCAP：分解代谢产物基因活化蛋白（：分解代谢产物基因活化蛋白（catabolite gene catabolite gen

19、e activator proteinactivator protein），又称环腺苷酸受体蛋白），又称环腺苷酸受体蛋白(cAMP (cAMP receptor proteinreceptor protein，CRPCRP）。）。 只有只有cAMP-CRPcAMP-CRP复合物结合到启动子的位点上，复合物结合到启动子的位点上，RNARNA聚合酶才能结合到其在启动子的位点上，酶的合成才聚合酶才能结合到其在启动子的位点上，酶的合成才能开始。能开始。 31操纵基因（操纵基因（Operater geneOperater gene）: : 位于启动基因和结构基因之间的一段碱位于启动基因和结构基因之间的一

20、段碱基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。结构基因（结构基因（Structural geneStructural gene）: : 决定某一多肽的决定某一多肽的DNADNA模板，与酶有各自模板，与酶有各自的对应关系，其中的遗传信息可转录为的对应关系，其中的遗传信息可转录为mRNAmRNA，再翻译为蛋白质。再翻译为蛋白质。32原核生物中操纵子的类型原核生物中操纵子的类型1.1.诱导型操纵子：乳糖操纵子诱导型操纵子：乳糖操纵子2.2.阻遏型操纵子：色氨酸操纵子阻遏型操纵子：色氨酸操纵子33（三

21、）酶生物合成的调节机制（三）酶生物合成的调节机制2.2.分解代谢物阻遏作用分解代谢物阻遏作用1.1.酶生物合成的诱导作用酶生物合成的诱导作用3.3.酶生物合成的反馈阻遏作用酶生物合成的反馈阻遏作用34 酶合成诱导的现象：酶合成诱导的现象： 已知分解利用乳糖的酶有：已知分解利用乳糖的酶有： -半乳糖苷酶；半乳糖苷酶； -半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。实验：实验：（1）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成；胞内无上述三种酶合成； （2）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，

22、细胞内有上述三种酶合成；内有上述三种酶合成； （3）表明菌体生物合成的经济原则：）表明菌体生物合成的经济原则：需要时需要时才合成才合成。35调节调节基因基因操纵操纵基因基因乳糖酶结构基因乳糖酶结构基因PLacZLacYLacamRNA 阻遏蛋白阻遏蛋白（有活性）（有活性）基基 因因 关关 闭闭启启动动子子ORPLacZLacYLaca调节调节基因基因操纵操纵基因基因乳糖酶结构基因乳糖酶结构基因启启动动子子ORmRNAZmRNAYmRNAa 阻遏蛋白阻遏蛋白（无活性）（无活性） 基基 因因 表表达达mRNAA、乳糖操纵子的结构、乳糖操纵子的结构B、乳糖酶的诱导、乳糖酶的诱导 乳糖乳糖 阻遏蛋白阻

23、遏蛋白（有活性）（有活性）诱导诱导36 2. 2.末端产物阻遏末端产物阻遏 由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。 酶合成阻遏的现象：酶合成阻遏的现象： 实验：实验： （1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时， 检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在；检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在； （2）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。氨酸合成酶的活性降低，直至消失。 （3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，）表明色氨酸的存在

24、阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌体生长的经济原则体现了菌体生长的经济原则:不需要就不合成不需要就不合成。37 色氨酸操纵子色氨酸操纵子酶的阻遏酶的阻遏调节基因调节基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因mRNAmRNA酶蛋白酶蛋白阻遏蛋白不能与操纵基因结合，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，结构基因表达结构基因表达调节基因调节基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因辅阻遏物辅阻遏物代谢产物与阻遏蛋白结代谢产物与阻遏蛋白结合，使之构象发生变化合，使之构象发生变化与操纵基因结合，结构与操纵基因结合，结构基基因不能表达因不能表达38引起反馈阻遏的引起反馈阻遏的物质，称为共阻物质，称为共阻遏物或辅阻遏物。遏物或辅

25、阻遏物。举例：无机磷酸阻举例：无机磷酸阻遏碱性磷酸酶遏碱性磷酸酶无阻遏物时：添加阻遏物时： R P O S1 S2 DNA翻译mRNA R P O S1 S2 DNA共阻遏物共阻遏物磷酸单酯磷酸单酯 磷酸磷酸+ +醇醇碱性磷酸酶碱性磷酸酶39酶酶的的诱诱导导和和阻阻遏遏操操纵纵子子模模型型B.有活性阻遏蛋白加诱导剂有活性阻遏蛋白加诱导剂A.有活性阻遏蛋白有活性阻遏蛋白C.无活性阻遏蛋白无活性阻遏蛋白D.无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂操纵基因操纵基因启动基因启动基因调节基因调节基因结构基因结构基因 阻遏蛋白阻遏蛋白(有活性有活性)阻遏蛋白阻挡操纵基因阻遏蛋白阻挡操纵基因结构基因

26、不表达结构基因不表达诱导物诱导物诱导物与阻遏蛋白结合诱导物与阻遏蛋白结合,使阻遏蛋白不能起使阻遏蛋白不能起到阻挡操纵基因的作用到阻挡操纵基因的作用,结构基因可以表达结构基因可以表达酶蛋白酶蛋白mRNA阻遏蛋白不能跟操纵基因结合阻遏蛋白不能跟操纵基因结合, 结构基因可以表达结构基因可以表达阻遏蛋白阻遏蛋白(无活性无活性)酶蛋白酶蛋白mRNA代谢产物与阻遏蛋白结合代谢产物与阻遏蛋白结合,从而使阻遏蛋从而使阻遏蛋白能够阻挡操纵基因白能够阻挡操纵基因,结构基因不表达结构基因不表达代谢产物代谢产物40调控方式 阻遏蛋白 添加物 与操纵基因结合阻遏效应举例酶的诱导有活性不转录，继而不翻译诱导物转录，继而翻

27、译乳糖操纵子酶的阻遏无活性阻遏物不转录，继而不翻译色氨酸操纵子酶合成的诱导与阻遏操纵子模型调控作用对比酶合成的诱导与阻遏操纵子模型调控作用对比413.3.分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏n指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。n分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所过甲碳源（或氮源等）在

28、其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。42分解代谢物阻遏现象：分解代谢物阻遏现象： 实验：实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二二次生长现象次生长现象”(diauxie(diauxie或或biphasic growthbiphasic growth）。）。02468020406080 细胞 浓 度(OD)时 间(h) 这一现象

29、又称葡萄糖效应，这一现象又称葡萄糖效应，产生的原因是由于葡萄糖降解产生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。物阻遏了分解乳糖酶系的合成。此调节基因的产物是环腺苷酸此调节基因的产物是环腺苷酸受体蛋白（受体蛋白（CRPCRP）, ,亦称亦称降解物降解物基因活化蛋白（基因活化蛋白（CAPCAP）。）。43分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏RLacZLacYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基基 因因 表表达达CAP基因基因结构基因结构基因TCAPOCAP结结合部位合部位 RNA聚合酶聚合酶TcAMP -CAPP葡萄糖葡萄糖分解代分解代谢产物谢产物腺苷酸腺苷酸环化酶环化酶磷酸二酯磷酸

30、二酯酶酶ATPcAMP5-AMP抑制抑制激活激活葡萄糖降解物与葡萄糖降解物与cAMP的关系的关系cAMPCAP：降解物基因活化蛋白，环腺苷酸受体：降解物基因活化蛋白，环腺苷酸受体蛋白（蛋白（catabolic gene activation protein）降低降低cAMP浓度浓度使使CAP呈失活状态呈失活状态44（二）遗传控制（一劳永逸）（二）遗传控制（一劳永逸） 1.1.改良菌种改良菌种 (1) 使诱导型变为组成型使诱导型变为组成型选育组成型突变株选育组成型突变株可用来减少酶合成对诱导物的依赖性的突变作用称为调节性突可用来减少酶合成对诱导物的依赖性的突变作用称为调节性突变。变。突变的部位位

31、于突变的部位位于调节基因调节基因而非结构基因上，使它不能形成阻遏而非结构基因上，使它不能形成阻遏物或失去了结合阻遏物的能力，因而突变株在没有诱导物存在物或失去了结合阻遏物的能力，因而突变株在没有诱导物存在条件下，酶产量也能达到诱导水平。条件下，酶产量也能达到诱导水平。不需用诱导物能产生诱导酶的突变，称为组成型突变。不需用诱导物能产生诱导酶的突变，称为组成型突变。筛选此类突变株可采用以下方法：细胞经诱变后，在基质诱筛选此类突变株可采用以下方法：细胞经诱变后，在基质诱导物限制条件下进行恒化培养，从而筛选出不需诱导物的突变导物限制条件下进行恒化培养，从而筛选出不需诱导物的突变株；把经诱变后的细胞接种

32、于只含有非诱导物基质的琼脂培株；把经诱变后的细胞接种于只含有非诱导物基质的琼脂培养基上，只有组成型的突变株能在此条件下生长，因而定向筛养基上，只有组成型的突变株能在此条件下生长，因而定向筛选出组成型突变株。选出组成型突变株。45(2)使阻遏型变为去阻遏型使阻遏型变为去阻遏型n获得的突变株在通常引起阻遏的条件下酶产量也获得的突变株在通常引起阻遏的条件下酶产量也达到无阻遏水平。达到无阻遏水平。n通过诱变使通过诱变使调节基因处发生突变调节基因处发生突变，从而产生一种，从而产生一种不能与辅阻遏物结合的阻遏物蛋白，或者在不能与辅阻遏物结合的阻遏物蛋白，或者在操纵操纵基因上突变基因上突变，使不能结合阻遏物

33、可获得调节性突，使不能结合阻遏物可获得调节性突变株。变株。n这类组成型突变株可用以下方法筛选：这类组成型突变株可用以下方法筛选： 筛选耐终产物结构类似物的突变株。例如分离筛选耐终产物结构类似物的突变株。例如分离出的耐乙硫氨酸突变株，其胱硫醚合成酶产量增出的耐乙硫氨酸突变株，其胱硫醚合成酶产量增加加120倍；倍； 有许多酶的合成受氨的阻遏，筛选耐甲基胺的有许多酶的合成受氨的阻遏，筛选耐甲基胺的突变株可去除氨对酶的阻遏作用。突变株可去除氨对酶的阻遏作用。 462. 基因工程育种基因工程育种 n通过基因工程手段改变细胞的调节基因，从通过基因工程手段改变细胞的调节基因，从而使菌种由诱导型变为组成型，阻

34、遏型变为而使菌种由诱导型变为组成型，阻遏型变为去阻遏型，提高菌种的酶生产能力；去阻遏型，提高菌种的酶生产能力；n另一方面可通过增加结构基因的拷贝数增加另一方面可通过增加结构基因的拷贝数增加细胞专一性酶的生产；细胞专一性酶的生产；n将有关结构基因转移给受体培养物，以提高将有关结构基因转移给受体培养物，以提高细胞酶的产量。细胞酶的产量。 47第二节第二节 酶发酵动力学酶发酵动力学发酵动力学是研究发酵过程中细胞生长速率、产发酵动力学是研究发酵过程中细胞生长速率、产物生长速率、基质消耗速率以及环境因素对这些物生长速率、基质消耗速率以及环境因素对这些速率的影响规律的学科。速率的影响规律的学科。发酵动力学

35、主要包括发酵动力学主要包括细胞生长动力学、细胞生长动力学、产物生成产物生成动力学（产酶动力学）动力学（产酶动力学）和基质消耗动力学和基质消耗动力学。48一、酶生物合成的模式一、酶生物合成的模式二、细胞生长动力学二、细胞生长动力学三、产酶动力学三、产酶动力学本节主要内容本节主要内容:酶发酵动力学研究意义酶发酵动力学研究意义:了解酶生物合成模式了解酶生物合成模式发酵工艺条件优化控制发酵工艺条件优化控制提高酶产量提高酶产量49 微生物生长曲线微生物生长曲线1.1.延迟期（调整期）延迟期（调整期） 2.2.对数生长期对数生长期 3.3.稳定期（平衡期）稳定期（平衡期） 4.4.衰亡期衰亡期1234一、

36、酶生物合成的模式一、酶生物合成的模式50 1.1.迟缓期迟缓期（1 1）主要特征：代谢活跃，大量合成细胞分裂所需）主要特征：代谢活跃，大量合成细胞分裂所需的酶类、的酶类、ATPATP等；体积增大；分裂迟缓。等；体积增大；分裂迟缓。（2 2）原因：在新的环境，缺乏分解或催化相关底物）原因：在新的环境，缺乏分解或催化相关底物的酶。的酶。（3 3）缩短和消除迟缓期的方法有：增加接种量、采）缩短和消除迟缓期的方法有：增加接种量、采用最适种龄、选用繁殖速度快的菌种以及尽量保用最适种龄、选用繁殖速度快的菌种以及尽量保持接种前后所处的培养基介质和条件一致。持接种前后所处的培养基介质和条件一致。 2.2.对数

37、期对数期（1 1）特点：分裂速度最快、倍增时间最短、代谢活）特点：分裂速度最快、倍增时间最短、代谢活动旺盛、对环境变化敏感。动旺盛、对环境变化敏感。（2 2）作用：作为代谢、生理等研究的好材料和发酵）作用：作为代谢、生理等研究的好材料和发酵生产中用作种子的最佳菌龄。生产中用作种子的最佳菌龄。51 3.3.稳定期稳定期（1 1）特点：新生的细胞和死亡的细胞数目相等、）特点：新生的细胞和死亡的细胞数目相等、总菌数达到最大值、代谢活力钝化。总菌数达到最大值、代谢活力钝化。（2 2）原因：营养物质的逐渐消耗以及代谢废物的）原因：营养物质的逐渐消耗以及代谢废物的积累抑制了生长。积累抑制了生长。（3 3）

38、功能：产生次生代谢产物（抗生素、生物碱）功能：产生次生代谢产物（抗生素、生物碱、色素等）、芽孢；对稳定期的研究发展了连、色素等）、芽孢；对稳定期的研究发展了连续培养技术。续培养技术。 4.4.衰亡期衰亡期 特点：活的细胞数目以对数速率急剧下降、细胞特点：活的细胞数目以对数速率急剧下降、细胞裂解或自溶裂解或自溶。52酶生物合成的模式酶生物合成的模式 根据根据酶的合成与细胞生长之间酶的合成与细胞生长之间的关系，可将酶的关系，可将酶的生物合成分为的生物合成分为3 3种模式，即：种模式，即： 同步合成型同步合成型 生长偶联型生长偶联型 中期合成型中期合成型 部分生长偶联型部分生长偶联型延续合成型延续合

39、成型 非生长偶联型非生长偶联型 滞后合成型滞后合成型53（1 1）同步合成型：）同步合成型： 酶的合成与细胞的生长同步进行酶的合成与细胞的生长同步进行（2 2）中期合成型）中期合成型 酶的合成在细胞生长一段时间后酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，进入平衡期后，酶的合才开始，进入平衡期后，酶的合成随之停止。成随之停止。 （3 3）延续合成型：）延续合成型： 酶的合成伴随着细胞的生长而开酶的合成伴随着细胞的生长而开始，始， 生长进入平衡期后，酶又生长进入平衡期后，酶又延续合成一段时间。延续合成一段时间。 (4) (4) 滞后合成型滞后合成型 当细胞进入平衡期后，才开始并当细胞进入平衡期后，才开始

40、并大量积累酶。大量积累酶。go54（1 1）酶的生物合成可以诱）酶的生物合成可以诱导，不受分解代谢物阻遏导，不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏；和反应产物阻遏；（2 2）当除去诱导物或细胞）当除去诱导物或细胞进入平衡期后，酶的合成进入平衡期后，酶的合成立即停止；立即停止；（3 3）酶所对应的）酶所对应的mRNAmRNA很不很不稳定。稳定。同步合成型的特点同步合成型的特点（生长偶联型）（生长偶联型）a 酶细 胞细胞 或酶浓 度时间55中期合成型的特点中期合成型的特点（生长偶联型）（生长偶联型）（1 1）酶的合成）酶的合成受到产物的反馈受到产物的反馈阻遏或分解代谢阻遏或分解代谢物阻遏；物阻遏；（2

41、2）所对应的）所对应的mRNAmRNA不稳定。不稳定。56（1 1）酶的合成可以诱导，不受分解代谢物或产物的阻遏；）酶的合成可以诱导，不受分解代谢物或产物的阻遏；（2 2）酶所对应的）酶所对应的mRNAmRNA相当稳定，在生长平衡期后仍可继续相当稳定，在生长平衡期后仍可继续较长时间用于酶的合成。较长时间用于酶的合成。延续合成型的特点（部分生长偶联型）延续合成型的特点（部分生长偶联型）b酶细胞 细胞 或酶浓 度时 间040801200204060 细 胞浓度 酶浓度酶浓度 (单位/ml)时 间 (h)0.012.525.037.550.0细 胞浓度 (g/L) 黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲线黑曲霉

42、聚半乳糖醛酸酶合成曲线57（1 1）在对数生长期）在对数生长期不合成酶（可能是不合成酶（可能是受到分解代谢物阻受到分解代谢物阻遏的影响）；遏的影响）；（2 2）所对应的）所对应的mRNAmRNA稳定性高。稳定性高。滞后合成型的特点滞后合成型的特点（非生长偶联型）非生长偶联型）c酶细胞细胞 或酶浓 度时 间58（1 1）mRNAmRNA的稳定性；的稳定性；（2 2）培养基中阻遏物存在与否。）培养基中阻遏物存在与否。影响酶生物合成的模式的主要因素是：影响酶生物合成的模式的主要因素是：（1 1）mRNAmRNA稳定性稳定性高高的，可在细胞停止生长后继续合成其所对应的的，可在细胞停止生长后继续合成其所

43、对应的酶；酶；（2 2）mRNAmRNA稳定性稳定性差差的，酶的合成随着细胞停止生长而终止；的，酶的合成随着细胞停止生长而终止；（3 3）受某些物质阻遏的，需在细胞生长一段时间或在平衡期后）受某些物质阻遏的，需在细胞生长一段时间或在平衡期后（解除阻遏），开始合成酶。（解除阻遏），开始合成酶。（4 4）不受某些物质阻遏的，酶的合成随着细胞生长而同步增长。）不受某些物质阻遏的，酶的合成随着细胞生长而同步增长。规律：规律：59 酶生产中最理想的合成模式：酶生产中最理想的合成模式：延续合成型：延续合成型：发酵过程中没有生长期和产酶期的明显发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞开始生长就有酶的产生

44、，直至细胞生长进差别。细胞开始生长就有酶的产生，直至细胞生长进入平衡期后，酶还可以继续生成一段时间。入平衡期后，酶还可以继续生成一段时间。改造非理想模式：改造非理想模式：同步合成型：同步合成型：提高对应的提高对应的mRNAmRNA的稳定性，如降低发酵的稳定性，如降低发酵 温度温度 。滞后合成型：滞后合成型：尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使 酶的合成提早开始。酶的合成提早开始。中期合成型：中期合成型：要在提高要在提高mRNAmRNA稳定性以及解除阻遏两方稳定性以及解除阻遏两方 面努力面努力。60二、细胞生长动力学二、细胞生长动力学主要研究细胞生长速度及其受外界

45、环境影响的规律。主要研究细胞生长速度及其受外界环境影响的规律。19501950年年, ,法国的法国的MonodMonod首先提出表述微生物生长的动力首先提出表述微生物生长的动力学方程学方程, ,细胞生长速率与细胞浓度成正比细胞生长速率与细胞浓度成正比. .Rx =dX/dt= Xu: 比生长速率比生长速率只存在一种限制性基质时只存在一种限制性基质时: :MonodMonod方程是基本的细胞生长动力学方程方程是基本的细胞生长动力学方程; ;从不同情况出发对其进行修饰从不同情况出发对其进行修饰. .61MonodMonod方程与米氏方程相似方程与米氏方程相似, ,参数参数u um m与与KsKs也

46、也可由双倒数作图法求出可由双倒数作图法求出. .双倒数作图法双倒数作图法6263 当产物的生成需要额外消耗底物时，底物的消耗用于生长、维持和代谢产物的生成即*1SGpdSXdPm XdtYYdt三、基质消耗动力学三、基质消耗动力学四、产酶动力学四、产酶动力学宏观产酶动力学宏观产酶动力学（非结构动力学）（非结构动力学）: :从整个发酵系统着眼从整个发酵系统着眼, ,研究群体细胞的产酶速率研究群体细胞的产酶速率 ；微观产酶动力学微观产酶动力学（结构动力学）（结构动力学）: :从细胞内部着眼从细胞内部着眼, ,研究细胞中酶合成速率。研究细胞中酶合成速率。1、分类、分类研究细胞产酶速率及各因素对其的影

47、响研究细胞产酶速率及各因素对其的影响. .64X细胞浓度；细胞浓度；细胞比生长速率；细胞比生长速率； 生长偶联的比产酶系数；生长偶联的比产酶系数； 非生长偶联的比产酶速率。非生长偶联的比产酶速率。2、宏观产酶动力学方程通式、宏观产酶动力学方程通式dE/dt=(+)x（1 1）同步合成型：生长偶联型）同步合成型：生长偶联型 =0=0，dE/dt=dE/dt=X X（2 2）中期合成型：特殊生长偶联型）中期合成型：特殊生长偶联型 =0=0，dE/dt=dE/dt= X X 有阻遏存在时，有阻遏存在时， =0 =0，无酶产生，无酶产生 dE/dt=dE/dt= 0 0 阻遏解除后才开始合成酶阻遏解除

48、后才开始合成酶. .细胞产酶模式不同，产酶速率与细胞生长动力学关系也不同。细胞产酶模式不同，产酶速率与细胞生长动力学关系也不同。讨论讨论: :65（3 3）滞后合成型：非生长偶联型，）滞后合成型：非生长偶联型， =0 , =0 , dE/dt=XdE/dt=X（4 4）延续合成型：部分生长偶联型，）延续合成型：部分生长偶联型， 00， 00 dE/dt=dE/dt= X+XX+X有关模型参数一般通过线性化处理及尝试有关模型参数一般通过线性化处理及尝试误差法求出误差法求出. .dE/dt=(+)x66RA、Ri：有、无活性的阻遏蛋白；有、无活性的阻遏蛋白；Si、Sr：诱导物和阻遏物；诱导物和阻遏

49、物；cc：环腺苷酸接受蛋白环腺苷酸接受蛋白CRP与环腺苷酸与环腺苷酸CAMP的复合物；的复合物；RSi：RA与与Si的结合物，不与操纵基因结合；的结合物，不与操纵基因结合；RSr：Ri与与Sr的结合物，可与操纵基因结合，而使的结合物，可与操纵基因结合，而使 mRNA无法合成无法合成 。N：RNA的分解产物。的分解产物。附附:3、微观产酶动力学、微观产酶动力学（1）细胞内酶生物合成的一般模型）细胞内酶生物合成的一般模型（cf.P54)67第三节第三节 酶发酵生产的工艺控制酶发酵生产的工艺控制保藏细胞保藏细胞细胞活化细胞活化细胞扩大培养细胞扩大培养发酵发酵分离纯化分离纯化酶酶原生质体原生质体培养基

50、培养基固定化细胞固定化细胞工艺条件工艺条件控制控制68PH温度温度溶氧溶氧碳源碳源氮源氮源无机盐无机盐生长因素生长因素试管菌种培养茄瓶菌种培养摇瓶菌种培养孢子（菌体）悬液制备种子罐菌种培养发酵罐发酵发酵液预处理酶的分离纯化精制酶发酵生产的一般工艺流程酶发酵生产的一般工艺流程 69一、细胞活化与扩大培养一、细胞活化与扩大培养细胞活化：保藏细胞在使用之前必须接种于新鲜的斜细胞活化：保藏细胞在使用之前必须接种于新鲜的斜面培养基上，在一定条件下进行培养，以恢复细胞的面培养基上，在一定条件下进行培养，以恢复细胞的生命活力，这就叫细胞的活化。生命活力，这就叫细胞的活化。 种子培养基：用于细胞扩大培养的培养

51、基。氮源丰富碳源少温度、pH、溶解氧接种量：1-10% 70二、培养基的配制二、培养基的配制培养基：是指人工配制的用于细胞培养和发酵培养基：是指人工配制的用于细胞培养和发酵的各种营养物质的混合物。的各种营养物质的混合物。 水碳源氮源无机盐生长因素71碳是构成细胞的主要元素之一，也是所有酶的重要组成元素。碳是构成细胞的主要元素之一，也是所有酶的重要组成元素。 碳源可作能源，为生命活动提供能量碳源可作能源，为生命活动提供能量不同微生物对碳源的利用有所不同，在酶发酵生产中还要注意某些不同微生物对碳源的利用有所不同，在酶发酵生产中还要注意某些碳源对酶生物合成具有代谢调节作用（诱导和阻遏）碳源对酶生物合

52、成具有代谢调节作用（诱导和阻遏）常用碳源：糖类、醇类、脂类、有机酸、烃类、蛋白质及其降解物常用碳源：糖类、醇类、脂类、有机酸、烃类、蛋白质及其降解物水是微生物最基本的组成分（水是微生物最基本的组成分（）水是微生物体内和体外的溶剂（吸收营养成分和代谢废物）水是微生物体内和体外的溶剂（吸收营养成分和代谢废物）水是细胞质组分，直接参与各种代谢活动水是细胞质组分，直接参与各种代谢活动调节细胞温度和保持环境温度的稳定（比热高，传热快）调节细胞温度和保持环境温度的稳定（比热高，传热快）|水水|碳源碳源选择合适碳源，以适应目的酶的合成调节机制选择合适碳源，以适应目的酶的合成调节机制72构成细胞物质和代谢产物

53、中氮素（不能用作能源构成细胞物质和代谢产物中氮素（不能用作能源 ）氮源氮源有机氮源有机氮源蛋白胨、酵母膏、牛肉膏蛋白胨、酵母膏、牛肉膏无机氮源无机氮源铵盐、硝酸盐铵盐、硝酸盐 参与酶的组成、构成酶活性基、激活酶活性参与酶的组成、构成酶活性基、激活酶活性维持细胞结构的稳定性维持细胞结构的稳定性调节细胞渗透压调节细胞渗透压控制细胞的氧化还原电位控制细胞的氧化还原电位有时可作某些微生物生长的能源物质有时可作某些微生物生长的能源物质 常用：硫酸盐、常用：硫酸盐、磷酸盐、氯化物磷酸盐、氯化物以及含有钾、钠、以及含有钾、钠、钙、镁、铁等元钙、镁、铁等元素的化合物。素的化合物。 |氮源氮源|无机盐无机盐需要

54、注意合适的碳氮比需要注意合适的碳氮比73|生长因子生长因子生长因子是指某些微生物不能用普通的碳源、氮源物质进生长因子是指某些微生物不能用普通的碳源、氮源物质进行合成，而必须另外加入少量的生长需求的有机物质。行合成，而必须另外加入少量的生长需求的有机物质。 分类：分类：化学结构分成维生素、氨基酸、嘌呤（或嘧啶）及其衍化学结构分成维生素、氨基酸、嘌呤（或嘧啶）及其衍生物和类脂成分生物和类脂成分 等四类等四类功能：以辅酶与辅基的形式参与代谢中的酶促反应功能：以辅酶与辅基的形式参与代谢中的酶促反应 实验室中常用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等作为各种生长因实验室中常用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等作为各种生长因子的

55、需要，麦芽汁、米曲汁等天然培养基中本身含有各种子的需要，麦芽汁、米曲汁等天然培养基中本身含有各种生长因子生长因子 74各种生物对营养的需求各种生物对营养的需求75n1 1、选择适宜的营养物质、选择适宜的营养物质n2 2、营养物的浓度及配比合适、营养物的浓度及配比合适n3 3、物理、化学条件适宜、物理、化学条件适宜n4 4、经济节约、经济节约n5 5、精心设计、试验比较、精心设计、试验比较培养不同的微生物必须采用不同的培养条件；培养不同的微生物必须采用不同的培养条件；培养目的不同，原料的选择和配比不同；培养目的不同，原料的选择和配比不同；不同阶段，培养条件也有所差异。不同阶段，培养条件也有所差异

56、。培养基的设计原则培养基的设计原则76实验室的常用培养基：实验室的常用培养基：细菌：细菌： 牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）；牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）；放线菌：高氏放线菌：高氏1 1号合成培养基培养；号合成培养基培养；酵母菌：麦芽汁培养基；酵母菌：麦芽汁培养基；霉菌：霉菌： 查氏合成培养基；查氏合成培养基；77三、三、pHpH调节调节n不同的细胞，其生长繁殖的最适不同的细胞，其生长繁殖的最适pHpH值有所不同。一值有所不同。一般细菌和放线菌的生长最适般细菌和放线菌的生长最适pHpH值在中性或碱性范围值在中性或碱性范围（pH6.5pH6.58.08.0）；霉菌和酵母的

57、最适生长）；霉菌和酵母的最适生长pHpH值为偏值为偏酸性酸性(pH4(pH46)6)；植物细胞生长的最适；植物细胞生长的最适pHpH值为值为5 56 6。78n细胞发酵产酶的最适细胞发酵产酶的最适pHpH值与生长最适值与生长最适pHpH值往往有所不同。值往往有所不同。细胞生产某种酶的最适细胞生产某种酶的最适pHpH值通常接近于该酶催化反应的值通常接近于该酶催化反应的最适最适pHpH值。值。n有些细胞可以同时产生若干种酶，在生产过程中，通过有些细胞可以同时产生若干种酶，在生产过程中，通过控制培养基的控制培养基的pHpH值，往往可以改变各种酶之间的产量比值，往往可以改变各种酶之间的产量比例。例。例

58、如，采用米曲霉发酵生产蛋白酶时，当培养基的例如，采用米曲霉发酵生产蛋白酶时，当培养基的pHpH值为碱性时，主要生产碱性蛋白酶；培养基的值为碱性时，主要生产碱性蛋白酶；培养基的pHpH值为值为中性时，中性时， 主要生产中性蛋白酶；而在酸性的条件下，则主要生产中性蛋白酶；而在酸性的条件下，则以生产酸性蛋白酶为主。以生产酸性蛋白酶为主。79培养基的培养基的pHpH值与培养基的组成成分以及发酵工艺条件密切相关。值与培养基的组成成分以及发酵工艺条件密切相关。n含糖量高的培养基，由于糖代谢产生有机酸，会使含糖量高的培养基，由于糖代谢产生有机酸，会使pHpH值向酸性值向酸性方向移动；方向移动；u含蛋白质、氨

59、基酸较多的培养基，经过代谢产生较多的胺类物含蛋白质、氨基酸较多的培养基，经过代谢产生较多的胺类物质，使质，使pHpH值向碱性方向移动；值向碱性方向移动；u以硫酸铵为氮源时，随着铵离子被利用，培养基中积累的硫酸以硫酸铵为氮源时，随着铵离子被利用，培养基中积累的硫酸根会使根会使pHpH值降低；值降低；u以尿素为氮源的，随着尿素被水解生成氨，而使培养基的以尿素为氮源的，随着尿素被水解生成氨，而使培养基的pHpH值值上升，然后又随着氨被细胞同化而使上升，然后又随着氨被细胞同化而使pHpH值下降；值下降；u磷酸盐的存在，对培养基的磷酸盐的存在，对培养基的pHpH值变化有一定的缓冲作用。值变化有一定的缓冲

60、作用。u在氧气供应不足时，由于代谢积累有机酸，可使培养基的在氧气供应不足时，由于代谢积累有机酸，可使培养基的pHpH值值向酸性方向移动。向酸性方向移动。80发酵过程中，发酵过程中，pHpH值控制和调节方法值控制和调节方法: :u调节调节pHpH值的方法可以通过改变培养基的组分或其值的方法可以通过改变培养基的组分或其比例；比例；u也可以使用缓冲液来稳定也可以使用缓冲液来稳定pHpH值；值；u或者在必要时通过流加适宜的酸、碱溶液的方法，或者在必要时通过流加适宜的酸、碱溶液的方法，调节培养基的调节培养基的pHpH值，以满足细胞生长和产酶的要值，以满足细胞生长和产酶的要求。求。81四、温度的调节控制四