离子交换色谱在细菌素分离纯化中的应用

1、570文章编号:10052376X(2010)0620570203ChineseJournalofMicroecology,Jun12010,Vol122No16【综述】离子交换色谱在细菌素分离纯化中的应用陆泉,施波,李瑞胜,蔡庆霞,陈晓琳,张明(安徽农业大学生命科学学院,安徽合肥230036)【摘要】近年来,乳酸菌细菌素在食品防腐剂和医药领域有着广泛的应用前景,而细菌素的分离纯化是其分子结构及遗传学特性等相关研究的重要基础。离子交换色谱是细菌素分离纯化的主要手段之一。本文阐述了离子交换色谱原理,分析了影响离子交换色谱分离纯化细菌素的各种因素,探讨了细菌素分离纯化中离子交换色谱条件的选择。【关

2、键词】离子交换色谱;细菌素;分离纯化【中图分类号】Q93233【文献标识码】ATheapplicationofionexchangechromatographyforthepurificationofbacteriocinsLUQuan,SHIBo,LIRui2sheng,CAIQing2xia,CHENXiao2lin,ZHANGMing(CollegeofLifeScience,AnhuiAgricultureUniversity,Hefei230036,China)【Abstract】Duringthelastfewdecades,lacticacidbacteriabacterioci

3、nshavebeenwidelyexploredandinvestigatedasfoodpreservativesandpharmaceuticals.Andthehomogeneitybacteriocinsarenecessaryforthestudiesofbiochemicalandgeneticcharacterization.IonExchangeChromatography(IEC)isprobablythemostfrequentlyusedchromatographictechniqueforthepurificationofbacteriocins.Inthispaper

4、,theprinciplesofIEC,theeffectsofthevariousfactorsontheionexchangeprocess,andtheexperimentaldesignofIECforthepurificationofbacteriocinswerereviewed.【Keywords】IEC;Bacteriocin;Purification细菌素(bacteriocin)是某些细菌在代谢过程中通过核糖体合成的一类具有抑菌活性的多肽或蛋白质,主要抑制同种或亲缘关系较近的细菌,1,2副作用,年,联合国粮食及农业组织(FAO)/(WHO)联合食品添加剂专家委员会确认nis

5、in可作为高效安全的天然防腐剂使用3,现广泛应用于食品保鲜、医疗保健和兽医饲料等领域4,5。在细菌素的理论和应用研究中,细菌素的分离纯化是其分子结构及遗传学特性等相关研究的重要基础。基于细菌素所带电荷及分子量大小等特征,可通过离子交换色谱、凝胶色谱、疏水作6用色谱和反相色谱等技术进行分离纯化。其中,离子交换色谱是根据各种蛋白质所带电荷的不同达到分离纯化的目的,该方法具有操作方便、分辨率高、交换容量大等特点,已成为蛋白质分离纯化中最常用的手段之一7,在细菌素的纯化过程中离子交换色谱亦是主要的分离手段,如在细菌素Para28910cin1.7、UbericinA、mesenterocinE131、

6、curvaticin1112L442和carnocinKZ213等的纯化过程中均使用了离子交换色谱。本文综述了离子交换色谱的原理,细菌素分离纯化中离子交换色谱条件的选择,为其更好的应用于细菌素的分离纯化提供参考。1离子交换色谱简介7,131.1离子交换色谱原理离子交换色谱(ionexchangechro2matography,IEC)是以离子交换剂为固定相,根据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力强【收稿日期】2010203217【基金项目】国家863计划项目(2008AA10Z319);安徽省高校“十一五”优秀人才计划(【教秘人】20042100)【作者简介】陆泉(1

7、9832),男,硕士研究生,研究方向为微生物生理学,Email:luquan;张明,通讯作者,Email:zhangming。1.2,。离子交换剂,称为阳离子交换剂(cationexchanger),常见的功能基团如磺丙基(sulfopropyl,SP)和羧甲基(carboxymethyl,CM)等;离子交换剂的功能基团能与带负电的离子基团发生交换作用的,称为阴离子交换剂(anionexchanger),常见的功能基团如季铵基(quaternaryammonium,Q)和二乙基氨乙基(diethylaminoethyl2ene,DEAE)等。又根据功能基团的解离性质,离子交换剂还可分为强离子交

8、换剂和弱离子交换剂;前者如磺丙基、季铵基,后者如羧甲基、二乙基氨乙基。离子交换剂的强弱并不是指蛋白质与交换剂结合的牢固程度,而是取决于带电功能基团的酸离解常数pKa的大小。1.3离子交换色谱中的疏水作用和吸附作用7,14在离子交换色谱中,虽然蛋白质与离子交换剂的结合以相反电荷之间的离子键为主,但实际上还存在疏水作用和吸附作用,这些作用对于物质的保留有着一定的影响。离子交换过程中如果使用带有非极性骨架的离子交换剂就会出现疏水作用,如离子交换树脂。这类离子交换剂的非极性骨架带有较强的疏水性,能与蛋白质分子中的某些疏水性氨基酸残基结合。在离子交换色谱柱的长期使用过程中,部分功能基团可能会流失,暴露出

9、固定相的基质,此时溶质离子易与固定相基质发生吸附作用;或者,被测样品中有的溶质离子未被彻底洗脱,附着在固定相表面,导致溶质离子有可能与色谱固定相上的污染物发生吸附作用。因此,离子交换色谱中的吸附作用与固定相的种类和结构密切相关。1.4离子交换色谱的保留机制15离子交换色谱对生物大分子的色谱保留行为是一个十分复杂的过程,这主要是因为在细菌素和酶等蛋白类物质的分离过程中,除了静电作用以外,还存在被分离物质与离子交换剂表面的疏水作用和吸附作用等。对离子色谱保留机理的研究历经了很长一段时间,目前普遍认可的可用于表征生物大分子色谱保留行为的模型是计量置换模型(stoichiometricdisplace

10、mentmodelforreten2中国微生态学杂志2010年6月第22卷第6期tion,SDM2R)。SDM2R模型从热力学平衡常数出发,描述体系中溶质、流动相和固定相分子间多种相互作用,进而计算出组分间相互作用的定量关系及其量度的大小。SDM2R为我们571定范围。文献报道的多见于选择比pI高12个pH单位811,1729,MOTTA等16选择比pI低12个pH单位。对于分离自天然产物的细菌素来说,在分离纯化的初期很可能对目的成分的性质不清楚,此时对于起始缓冲液pH的确定可用试管法13。起始缓冲液的浓度一般比较低,介于1050912,18,2225,27298,17,19,21,26mmo

11、l/L,以20mmol/L、50mmol/L为主,10mmol/L16,20较少见。低浓度可以保证目的蛋白在吸附阶段能够结合到交换剂上,但过低的起始浓度有可能造成蛋白质在离子交换剂上吸附过于牢固而增加洗脱的困难。2.3.3非缓冲盐在流动相中,非缓冲盐的离子强度和pH一样重要,这两个因素共同控制着蛋白质在离子交换色谱柱上的保留行为、分离度和回收率。在进行色谱分离时,使用不同的非缓冲盐离子,可能造成不同物质被洗脱的顺序发生变化。在阳离子交换剂上,蛋白质的保留值与无机盐离子的关系为Ba2+<Ca2+<Mg2+<NH4+<K+<Na+<Li+;在阴离子交换剂上,它们

12、的关系为F-<Cl-<Br-<I-。细菌素纯化中,选择的盐离子一般为置换能力居中的无机离子,例如+812,1629Na,在洗脱与交换剂结合牢固的蛋白质时,选用强的置换离子具有优势。对于特定的样品来说,需要多大的离子强度才能将其从离子交换剂上洗脱下来,并没有一个固定的规律,需要从实验中摸索。文献报道的最大浓度有1.510,11,16mol/L、1.0mol/L8,17,18,20,24、0.6mol/L25、0.59,19,23,26,29mol/L。但有效的洗脱浓度各异,LacticinZ21、Lac2192210ticinQococcinQocinE131的有效洗脱度为5m

13、ol/L、0.75mol/L0.8。2.3.一般认为理论塔板数在1.5ml/min以,在2.0ml/min以上的流速区无明显的增加。增大流速会减小溶质保留;减小流速可增加样品各组分间的分离度,但是要考虑待测样品的分离纯化时间、活性、峰展宽和成本的影响,且只能在一定范围内减小流速。细菌素的纯化中,洗脱阶段的流速各异,有18,18,24,25,27,29ml/min、1.2ml/min28、2ml/min11,22、5917ml/min和10ml/min。2.4洗脱技术离子交换色谱洗脱时,要想使样品从离子交换剂上洗脱下来,可采用的方法有:(1)改变洗脱剂的pH:这是为了使蛋白质分子带电情况发生变化

14、,当接近蛋白质等电点时,蛋白质分子所带净电荷为零,从交换剂上解吸附并被洗脱下来;(2)增加洗脱剂的离子强度:蛋白质与交换剂的带电状态均未改变,但无机离子与蛋白质竞争结合交换剂,降低蛋白质与交换剂的相互作用而被洗脱下来,此方法为纯化细菌素过程中最常用的方法。根据洗脱剂发生改变时,其pH或离子强度是否连续,洗脱技术分为步进式洗脱(stepwiseelution)和梯度洗脱(gradientelution)。细菌素纯化中以离子强度梯度洗脱为主812,1620,2329,步进式较少21,22。2.5样品的预处理离子交换色谱要求样品中必须无颗粒状物质存在,因而要对样品进行适当处理。一般来说,所使用的分离

15、介质颗粒越小,对样品溶液的澄清度要求越高。在使用平均粒度在90m以上的介质时,使用孔径为1m的滤膜进行过滤就能够达到要求;在使用平均粒度小于90m的介质时,应使用孔径为0.45m的滤膜进行过滤;需要无菌过滤时,可使用孔径为0.22m的滤膜进行过滤。当样品体积非常小或滤膜对目的蛋白有吸附作用时,为了减少样品的损失,7可选择10000×g离心15min除去颗粒物。同时离子交换色谱进行细菌素纯化时要求低盐浓度,而且要有合适的pH以保证细菌素表面有足够的电荷与固定相表面发生相互作用,文献报道的常用样品处理方法为将待测样品冷冻干燥后提供了一种可以利用离子交换色谱分离具有相似化学和生物学性质的蛋

16、白质的方法。2离子交换色谱分离纯化细菌素的条件选择影响离子交换色谱保留的因素有很多,如色谱柱的尺寸、流动相种类、洗脱液浓度和流动相流速等,这些是利用离子交换色谱分离纯化细菌素的首要考虑因素,另外样品中的物质成分也将影响到分离效果,因而还要对样品进行适当的处理。2.1色谱柱的尺寸色谱柱的尺寸通常用内径(mm)×高度(mm)来表示,其长度影响理论塔板数(即柱效)。离子交换色谱通常选用短的色谱柱,即高径比小的色谱柱,典型的离子交换柱高度在50200mm。柱床过高,会导致区带扩散、洗脱峰变宽。但这不是绝对的,有文献报道使用柱长为300mm的预装柱有效地分离了细菌素mesenterocinE1

17、3110和curva211ticinL442。2.2离子交换剂选择离子交换剂时,主要依据分离的要求和目的样品分子量的大小、等电点以及离子交换剂的有效交换容量等。在细菌素的分离纯化过程中,离子交换色谱一般处于中间步骤,样品达到了一定的纯度,大多数杂质已经除去,此时应当选择颗粒尺寸较大,具有大孔型结构,流速特性好的离子交换剂。基于此,细菌素的纯化中大量使用琼脂糖作为离子交换剂。这是一类在交联琼脂糖凝胶的基础上连接功能基团形成的离子交换剂,其孔径大(90m),天然蛋白质的分子量大小都低于它们的排阻极限。较少,MOTTA等16纯化细菌素BLSP34交换剂DEAESepharoseFastSProseF

18、astFlowMFlow8,9次之。1012,这是一(1030m)而有一定的硬度,分辨率很高的离子交换剂。2.3流动相离子交换色谱是利用不同物质对固定相和流动相的亲和力不同而进行分离的,流动相的选择同样影响分离效果。流动相分为两种:一种是起始缓冲液,用于蛋白质上样并洗去不吸附的杂质;另一种是洗脱缓冲液,用于洗脱吸附在柱上的蛋白质,它是向起始缓冲液中添加非缓冲盐得到的。非缓冲盐的作用是提高离子强度从而使蛋白质从交换剂上洗脱下来。2.3.1缓冲液的类型在离子交换过程中pH是否恒定直接影响到蛋白质能否结合到交换剂上以及结合力的强弱。缓冲液的选择遵循这样一个原则:使用阳离子交换剂时选择带负电荷的缓冲离

19、子;使用阴离子交换剂时选择带正电荷的缓冲离子。据文献报道,在细菌素纯化中多使用阳离子交换剂,缓冲液多为磷酸盐缓冲液1012,1624和柠檬酸盐缓冲液25,26;也有例外,HENG等9在纯化UbericinA使用的是22吗啡啉乙磺酸(22MES)。离子交换色谱可以除去很多的杂质,但经过离子交换色谱得到的目的蛋白的洗脱峰中含有大量的缓冲物质和盐的成分,这些成分对于目的蛋白来说也是一种杂质,因此收集的样品要经过脱盐或透析处理。使用挥发性的缓冲物质,就可以避免引入新的杂质,使得后期的处理较简便,如乙酸铵缓冲液8,2729。2.3.2缓冲液的pH和浓度离子交换色谱中分离蛋白质的基础是用pH来控制蛋白质的

20、电荷。缓冲液的pH可以选择在目的蛋白pI上下12个pH单位,这样既能保证目的蛋白有充足的电荷结合到交换剂上,又不致于结合得过于牢固而难以洗脱。而pH的具体选择应取决于pI和蛋白质的pH稳572溶解于起始缓冲液中812,1623,2728或将待测样品溶液装入透析袋中用起始缓冲液透析一定的时间2426,29,然后再过滤或离心处理。3离子交换色谱的应用展望离子交换色谱具有很多优点,如:应用灵活,可通过选择不同的离子交换剂,控制缓冲液的pH和离子强度等条件优化分离过程;商品化离子交换剂种类多,选择余地大,价格也相对便宜等。离子交换色谱技术不仅在细菌素的分离纯化中得到大量使用,而且被广泛的应用在生物化工

21、、制药、环保以及食品等领域中。离子交换色谱已经发展成为了分离和纯化蛋白质、核酸和其它带电生物分子的主要手段之一。【参考文献】1NETTLESCG,BAREFOOTSF.Biochemicalandgeneticcharacteris2ticsofbacteriocinoffood2associatedlacticacidbacteriaJ.JFoodProtect,1993,56(4):3382356.2KONISKYJ.ColicinsandotherbacteriocinswithestablishedmodeofactionJ.AnnRevMicrobiol,1982,36(1):125

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