胃舒散对消炎痛所致大鼠小肠损伤的保护作用(一)

1、胃舒散对消炎痛所致大鼠小肠损伤的保护作用(一)    【摘要】 目的： 研究胃舒散对消炎痛所致大鼠小肠损伤的保护作用及机制。方法： 皮下注射消炎痛(10mg/kg)制作大鼠小肠损伤模型。用光镜、扫描电镜和透射电镜观察不同剂量30、15、075g/(kg·d)胃舒散对小肠损伤的影响,同时检测小肠黏膜髓过氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量以及血清NO含量。结果：消炎痛引起明显的小肠黏膜损伤，伴有NO、MPO、MDA含量增加及SOD活性下降(P005,P001)。胃舒散剂量依赖性地减少小肠黏膜损伤指数, 提高了胃组

2、织SOD活性(P005)、 降低了MPO、 MDA含量(P005)， 但对血清NO水平无明显影响(P>005)。结论：氧自由基及NO参与了消炎痛所致小肠黏膜的损伤，胃舒散对此病变有明显保护作用，其机制与抗氧化作用有关。 【关键词】 小肠损伤 消炎痛 胃舒散 一氧化氮 超氧化物歧化酶 丙二醛AbstractObjective:To study the protective effect of Weishusan on small intestinal lesions induced by indomethacin in rats. Methods: Wistar rats were inj

3、ected indomethacin(suspension 10 mg/kg)subcutaneously, and the small intestine was examined for lesions 24 hours later. The different doses30、15、075 g/(kg·d)of Weishusan were administered i.g. twice, intestinal mucosal changes were observed by quantitative histology，scanning electron microscopy

4、 and transmisson electron microscopy. Superoxide dismutase(SOD)、myeloperoxidase(MPO)activities and malondialdehyde(MDA)levels in intestinal tissues and nitric oxide(NO)levels in serum were determined. Results: Severe lesions in the jejunum and ileum were caused by indomethacinand the NO、MPO and MDA

5、contents were markedly increased(P005). Weishusan dose_dependently prevented the intestinal lesions(P005), enhanced SOD activities(P005)and decreased MPO and MDA levels(P005) but not affected NO levels(P>005). Conclusion: Oxygen free radicals and NO may play important roles in intestinal lesions

6、induced by indomethacin. Weishusan can protect the small intestine by antioxidation mechanism.Key Wordsintestinal lesion; indomethacin; Weishusan; nitric oxide; superoxide dismutase; malondialdehyde近年，随着老年人口的增多，非甾体类消炎药(NSAID)在防治冠心病、风湿性骨关节炎等疾病中应用愈来愈广泛，其导致的胃肠疾病亦逐年增多。胃舒散是我院自行研制的中西药复方散剂，多年临床应用显示对胃炎、消化性溃

7、疡及胃肠功能紊乱等有良好的疗效1，2，但是否对药物引起的小肠损伤有治疗作用尚不清楚。本项目通过检测有关生化指标并借助光镜、电镜、生化技术观察胃舒散的保护作用，旨在探讨消炎痛致小肠损伤的机理并为临床寻找新的治疗方案。1材料与方法11 动物与药物Wistar大鼠汕头大学医学院实验动物中心提供。体质量(220±35)g，雌雄各半40只，分笼饲养，自由饮水(过滤除菌的自来水)。胃舒散由我院药剂科生产(批号：粤药制字H03050164)。12 模型制备及实验分组实验前大鼠禁食、水2h。模型制作：将消炎痛粉溶于质量分数5%碳酸氢钠溶液内，按10mg/mL浓度配成细混悬液，实验时按10mg/kg的

8、剂量1次皮下注射，24h后断颈处死动物。分组：胃舒散治疗组(在注射消炎痛前30min及注射后8h分别给予不同浓度但容量相同的胃舒散溶液，分2次灌胃)，胃舒散中剂量组(15g/kg，即按成人剂量15倍给药)，胃舒散高剂量组30g/(kg·d)和胃舒散低剂量组075g/(kg·d)。模型对照组用等量的体积分数085%的NS灌胃，正常对照组皮下注射NS，亦给等量的085% NS灌胃。注射消炎痛后大鼠禁食不禁水，在第2次灌胃前仍需禁水2h。13光镜检查大鼠处死后剖腹，沿肠系膜附着的对侧剪开小肠，在回肠中段6cm处取组织，用4等渗NS冲净肠内容物及黏液，体积分数10%的中性甲醛溶液固

9、定，常规脱水，石蜡包埋，连续切片，苏木精_伊红染色，光镜下观察，按NEC法进行小肠损伤评分3。14电镜观察扫描电镜：将大鼠小肠组织放入含透明质酸酶和_糜蛋白酶(pH 56)溶液中，在振荡器上持续振荡，去除黏膜面表层黏液，体积分数25%的戊二醛和体积分数2%的四氧化锇双重固定，常规乙醇系列脱水，醋酸异戊脂过渡，在HCP_2型临界点干燥仪(日立公司，日本)上干燥，喷金后在JSM_6360LA扫描电镜(JEOL公司，日本)下观察。透射电镜：将小肠在冷的4%的戊二醛_磷酸盐(pH 74)中切成小块，预固定2h，1%的锇酸后固定1h，环氧树脂包埋，LKB_2088型超薄切片机(LKB公司，瑞典)切片，醋

10、酸铀、硝酸铅双重染色后，在H_800型电镜(日立公司，日本)下观察。15生化指标检测取回肠中段组织，制成匀浆并离心，取上清液进行检测。SOD测定采用改良的亚硝酸盐法，在DU650型分光光度计(Beckman公司，美国)上测定，使空白管OD值下降50%的SOD量定为酶活力1个亚硝酸盐单位(NU/mg)。NO测定用NO酶法，设空白管、标准管和测定管，测定管内加入03mL待测血清，各管混匀放置10min，(35004000)r/min离心10min，取上清液08mL，加入显色剂04mL，混匀，15min后测其吸光度值，在标准曲线查找相应NO浓度(NU/mL)。MPO测定见参考文献4(U/g)。MDA

11、测定按硫代巴比妥酸缩合法，试剂盒由南京聚力生物有限公司提供。蛋白质测定采用Lowry法。16统计学处理计量资料及损伤指数用±s表示，用SPSS115统计软件，行单侧ANOVAE及t检验分析。2 结果21光学显微镜观察正常对照组上皮细胞排列整齐，形态基本正常，未见细胞明显损伤，少数炎性细胞浸润，损伤指数017±005。模型对照组小肠黏膜固有层水肿并伴有肠系膜缘炎性细胞浸润，小肠绒毛顶端上皮下可见囊状间隙，呈广泛黏膜炎症并伴纵向溃疡(深浅不一、点状、线状)，沿小肠壁环周围走向的溃疡少见，尤以中段及远端小肠病变明显，损伤指数231±075，明显高于正常对照组(P001)

12、。胃舒散高、中剂量组小肠黏膜损伤指数分别为128±047和135±050，与模型组比有统计学意义(P001，P005)。胃舒散小剂量组损伤指数为165±058，与模型组比无统计学意义(P>005)，表明高、中剂量胃舒散对小肠损伤具有保护作用。22扫描电镜观察正常对照组小肠黏膜绒毛约150m×50m，呈条柱状排列，表面光滑、完整，有片状皱折(图1A，封3)。模型对照组小肠上皮表面破损明显，有纵向溃疡(图1B，封3)。胃舒散中、高剂量组小肠黏膜损伤明显减轻，仅见点状溃疡，周边上皮结构完整(图1C，封3)。23 透射电镜观察正常对照组小肠黏膜为单层柱状上

13、皮，其间夹有少量杯状细胞，上皮游离面有丰富的微绒毛，上皮细胞间除游离端为紧密连接外，多数为中间连接和相嵌连接，胞质丰富，线粒体、粗面内质网较多。模型对照组上皮细胞极性消失，杯状细胞显著增多，黏膜柱状上皮细胞体积缩小，可见细胞凋亡小体，核有固缩、溶解现象，异染色质边集成半月状。胞质内线粒体断脊、空泡变性，溶解，粗面内质网脱颗粒，血管普遍扩张，毛细血管内皮细胞出现破裂(图2A，封3)。胃舒散中、高剂量组小肠黏膜上述损伤则较轻，无核膜断裂溶解，线粒体断脊，溶解少见(图2B，封3)。24胃舒散对大鼠血液NO、 小肠组织MPO、 SOD、MDA水平的影响从表中可见，模型对照组NO、MPO、MDA水平均明

14、显升高(P005)，胃舒散中、高剂量组可显著降低MPO、MDA的含量(P005)，但对NO活性无明显影响(P>005)；模型对照组SOD含量显著低于正常对照组(P001)，胃舒散中、高剂量组则可增加SOD活性，与模型对照组比有统计学意义(P005)。表1胃舒散对大鼠血液NO、小肠组织MPO、SOD、MDA水平的影响3讨论全球有约3500万人/d使用NSAID，美国约有因NSAID引发的不良胃肠反应而住院者12万人/d5。NSAID大部分呈脂溶形式，极易吸收，可直接破坏黏膜屏障，造成细胞内pH下降，渗透压上升，细胞肿胀乃至死亡。与此同时，它还可抑制前列腺素的产生，使受损伤的胃肠黏膜不能及时

15、修复，最终出现组织损伤。本实验结果表明，消炎痛能引起明显的小肠黏膜损伤，上皮表面呈现深浅不一的纵向溃疡，与文献报道结果一致6。中、高剂量组胃舒散能显著降低肠黏膜的损伤指数，证实胃舒散对消炎痛引起的急性小肠损伤具有治疗作用。氧自由基在阿斯匹林、乙醇诱导的胃黏膜损伤中的作用已得到证实，然而，消炎痛致小肠损伤的研究国内资料甚少。研究表明，在炎症产生过程中，炎性细胞可通过“呼吸爆发”而产生大量氧自由基。MPO存在于吞噬细胞颗粒中，有弱的过氧化氢酶活性，可产生自由基7。组织中SOD则具有清除超氧阴离子自由基的能力，一旦自由基产生过多或组织抗氧化能力减退，细胞则易发生脂质过氧化损伤并伴随其代谢产物MDA增

16、加，因此，MPO、SOD与MDA常被用作衡量组织氧化代谢的相关指标3，8。在肠缺血_再灌注损伤过程中常引起SOD活性下降，MDA水平增高9。消炎痛可诱导中性粒细胞在微血管内皮粘附，使局部血流减少，并引起血管收缩，而供血不足是产生自由基的主要原因之一10。我们观察到模型对照组小肠黏膜毛细血管充血、水肿及破裂，黏膜固有层有大量中性粒细胞浸润，血管损伤明显部位的组织病变较严重，并伴有MPO活性增加及MDA水平增高，说明自由基参与了此病变的过程，与文献报道一致710。高、中剂量胃舒散可降低MPO活性及MDA水平，阻遏小肠组织SOD水平的下降，说明胃舒散具有清除自由基的功能。NO在胃肠黏膜损伤中的作用近

17、年较受关注。在多种疾病发生、发展中呈现“双刃”作用，即生理状态下它可作为一种内源性活性物质发挥保护作用，如介导胃肠平滑肌的舒张，维持肠黏膜微循环屏障功能，降低微循环阻力，减轻血小板活化因子引起的肠损害，对WBC粘附和渗出起化学屏障作用，减少肠上皮通透性及促进急性损伤后上皮修复。病理情况下，NO作为一种重要的炎症介质，又具有细胞杀伤毒性与促炎作用11。一般认为，诱导型一氧化氮合酶(iNOS)主要分布于巨噬细胞、内皮细胞中，生理状态下并不表达，在内毒素和某些细胞因子的刺激下它才进行转录和翻译，催化生成大量NO。NO可直接引起细胞毒作用或通过氧自由基氧化生成毒性更大的ONOO-，而后者作为一种强氧化

18、剂具有强烈地抑制细胞线粒体氧化呼吸作用，导致能量代谢障碍而致细胞死亡12。Chen等13观察到消炎痛可引起肠黏膜MPO增加及损伤加重，同时伴有诱导型iNOS表达增加。给予NG_硝基_L_精氨酸甲基酯(L_NAME)抑制内源性NO合成则显著减少MPO活性并缓解小肠损伤。作者认为消炎痛引起肠黏膜损伤的机理与NO有关。研究还证实NO与超氧自由基O2均起损伤作用，而且具有相加的效果14。本文模型对照组MPO及NO水平增高，黏膜损伤加重，与上述作者的研究结果一致。胃舒散组NO水平虽有改变但与模型对照组比无统计学意义，提示在消炎痛引起的小肠损伤中，NO只起部分作用，胃舒散的治疗作用与NO无明显关系。由于我

19、们检测的是血液中而非组织中的NO含量，这种升高的NO究竟是产生保护作用还是起到损伤作用有待进一步研究。传统中医药在防治胃肠损伤方面有重要价值，如大黄具有清热、抗炎、通便的特性，常用于治疗肠道疾患。李新宇等9在研究中发现大黄素可抑制iNOS基因表达，调节NO的释放，防治大鼠缺血再灌注所致的肺损伤并减轻肠损伤。文献报道，具有健脾、活血功能的中药，可改善微循环状态15。我们在实验中观察到，有效剂量的胃舒散组小肠病损轻，尤其是毛细血管结构较完整，细胞线粒体、粗面内质网等细胞器肿胀、脱颗粒少见。据推测胃舒散具有细胞保护作用，其制剂中木香、大黄、石菖蒲、鸡骨香、甘草等健脾理气、活血解毒之成分，可能通过改善

20、黏膜微循环状态，增加局部组织供氧和改善能量代谢以及抗氧化作用而减少肠损伤。【参考文献】1吴灵飞， 王炳周， 冯家琳， 等. 根除幽门螺杆菌对消化性溃疡合并的胃炎及胃泌素的影响J. 临床消化病杂志， 2004， 16(6): 250-252.2吴灵飞， 郑宗茂， 李国平， 等. 胃舒散对功能性消化不良的疗效与幽门螺杆菌的关系J. 世界华人消化杂志, 2002， 10(3): 275-278.3Hammerman C， Goldschmidt D， Caplan MS，et al. Protective effect of bilirubin in ischemia_reperfusion inj

21、ury in the rat intestineJ. J Pediatr Gastroenterol Nutr, 2002,35(3): 344-349.4吴灵飞， 邓长生. L_SOD对DDC诱发大鼠急性胃粘膜损伤的保护作用J. 中国病理生理杂志,1994,10(3)： 302-305.5Ettarh RR, Carr KE. Morphometric analysis of the small intestinal epithelium in the indomethacin_treated mouseJ.J Anat,1996, 189(Pt 1): 51-56.6Ettarh RR,

22、Carr KE. Structural and morphometric analysis of murine small intestine after indomethacin administrationJ. ScandJ Gastroenterol,1993, 28(9): 795-802.7Bertrand V, Guessous F, Le_Roy AL, et al. Copper_indomethacinate associated with zwitterionic phospholipids prevents enteropathy in rats: effect on ind