纤维素柱填料的制备及其在超氧化物歧化酶提纯中的应用——武汉大

1、纤维素柱填料的制备及其在超氧化物歧化酶提纯中的应用（武汉大学化学与分子科学学院，武汉 430072）摘要：为制备一种成本较低、具有很高分辨性能和良好物理性能的新型尺寸排除色谱，并通过超氧化物歧化酶的分离纯化，了解有机试剂沉淀蛋白质以及梯度洗脱柱层析方法。将猪血中的超氧化物歧化酶SOD提纯出来，并采用聚乙二醇-2000（PEG2000）和纤维素铜氨溶液共混的方法，通过柱层析（即尺寸排阻色谱）达到酶的分级。关键字：超氧化物歧化酶、纤维素填料、尺寸排阻色谱、梯度洗脱中图分类号：O 643文献标识码：A0 引言超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，缩写为SOD）广泛存在于各类生物体

2、内。按其所含金属离子的不同分为3 种：铜锌超氧化物歧化酶（Cu.Zn-SOD）、锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)和铁超氧化物歧化酶（Fe-SOD）在生物体内，它是一种重要的自由基清除剂，能专一性的清除超氧化物阴离子自由基O2而保护细胞，能治疗多种炎症、放射病、自身免疫性疾病和抗衰老，对生物体有保护作用。在猪血液里，Cu.Zn-SOD 与血红蛋白等共存于红血球。通过一系列操作可从猪血中提取Cu.Zn-SOD，并通过DE-32 纤维素阴离子交换柱可得到进一步纯化。1 实验部分11.1 试剂与仪器（1）试剂CuSO4.5H2O, 20%NaOH, PEG2000, 棉短绒，4%硫酸，异丙醇，浓氨水，

3、95%乙醇，氯仿，K2HPO4.3H2O ,K2HPO4, 0.9%NaCl, 丙酮，10mmol/L HCl，新鲜猪血500mL，2.5%草酸钾，甲醛溶液。（2）仪器烧杯，量筒，1000mL分液漏斗，药匙，洗瓶，抽滤装置，玻璃搅拌棒，淋洗液瓶，电磁搅拌器，玻璃色谱柱，试管，台秤，机械水泵,电炉，注射器及针头，回收瓶（Cu(OH)2），紫外分光光度计（UV-1601 岛津），低温高速离心机。1.2 实验步骤1酶的制备（1）取新鲜猪血500 mL（已予先加入50 mL 2.5%草酸钾作为抗凝剂），3000转/min 离心20 min 除去上层血浆，收集红细胞约250 mL，加入等体积的0.9%N

4、aCl溶液，用玻璃棒搅拌充分洗涤，3000转/min 离心20min，弃去上清液（如此反复 3 次），收集洗净的红细胞放入800 mL 烧杯中，加250 mL 重蒸水，将烧杯置于冰浴中搅拌溶血40 min以上，得溶血液500 mL。（2）往溶血液中缓慢加入在4下预冷过的95%的乙醇125 mL（0.25 倍体积），然后再缓缓加入在4下预冷过的氯仿75 mL（0.15 倍体积），搅拌15 min，室温下3000转/min 离心20 min，弃去沉淀（血红蛋白），收集上清液约330 mL（留样，为酶1），此即酶的粗提液。（3）往上述液中加入K2HPO4·3H2O130 g，转移到分液漏斗

5、，振荡后静置分层（约15min）。收集上层乙醇-氯仿相（微浑浊），室温下离心（3500转/min）25min，弃去沉淀，得上清夜约100mL(留样为酶2)。（4）向上一步所得上清夜加入0.75 倍体积在4oC 下预冷过的丙酮，Cu·Zn-SOD便沉淀下来。室温下3500rpm离心20min ,收集灰白色沉淀物。将此灰白色沉淀物溶于约5mL 重蒸水中（呈悬浮状，留样为酶3），在4下，在250mL 200 mmolL-1pH7.6 的磷酸钾缓冲液中透析，每隔0.5h 换透析液一次，共换4 次。透析内液出现沉淀，在室温下3500转/min离心，弃去沉淀，收集上清液7 mL（留样，为酶4）。

6、2. 纤维素柱填料的制备（1）制备Cu(OH)216.50gCuSO4.5H2O 加132mLH2O，搅拌加热至沸后，缓缓加入8mL 25-28 0/0 的浓氨水，并搅拌。冷却至室温后，用水将沉淀洗至中性。倒出清液后，加112mL H2O入沉淀中，冰水浴条件下加入53mL 20%NaOH溶液并搅拌，草绿色变为天蓝色，再用水洗至中性，抽滤得天蓝色湿Cu(OH)2（含水率约60%）。（2）制备纤维素铜氨溶液7.60g 纤维素置于47.5g（53mL）浓氨水中，加入13mL 水后密封杯口置于冰箱中冷至10以下。将10.4g 含水率约60%的Cu(OH)2 加入到6.4g（6mL）10%NaOH 里，

7、搅拌均匀后倒入上述冷却的纤维素氨水溶液中，立即搅拌均匀置于冰箱。冷却后加13mL 水，继续搅拌，再冷却，再搅拌直至变为兰色清亮的粘稠溶液（）。纤维素浓度为8%，溶液总重量约96.43g。（3）柱填料的制备将8.03gPEG-2000 溶于40mL 水，制成20%PEG 水溶液（）。要求溶液（）为蓝色透明粘稠液体，溶液（）应为白色透明粘稠液体。各取（）和（）40mL，搅拌下混合均匀，得共混液（）。将共混液（）装入注射器中，注射器前端套上黄色枪头，均匀用力推出呈丝状的溶液，直接在10%的NaOH溶液中凝固15min。然后将所得的丝状物转移到4%的稀硫酸溶液中，放置30min，可以得到透明而均匀的细

8、丝。用水洗去酸，再把细丝切成长为1mm 以下的圆柱体，放在70的水中加热约1h，以除去其中的PEG-2000。此圆柱体为SEC 柱1#填料。同上法，不用共混液，而直接用纤维素铜氨液（）可制得SEC 柱2#填料。3. 酶的纯化和活性测定（1）纤维素柱层析：将实验1 所得柱填料1#和2#按体积比1:1 混合并填充玻璃色谱柱，柱体1.5×20cm，填装时不要混入气泡，同时轻轻敲打管壁，使填料填充紧密，均匀。装好后，填料的上部用一小团棉花覆盖，以保持胶床顶部平整，不受流入溶剂干扰。用2.5 mmol/LpH7.6 缓冲溶液作平衡液，用2.5mmolL-1(100mL)-200mmolL-1(

9、100mL)pH7.6 的磷酸钾缓冲溶液.按图1搭建梯度洗脱装置进行梯度洗脱。流速为40mLh-1，每管收集4mL，收约20管。以H2O为参比，在280nm处采用紫外吸收法测定每管的吸光度，绘制淋洗曲线。图1. 梯度洗脱装置图（2）邻苯三酚自氧化速率的测定在试管中按照表1加入缓冲液，于25 保温20 min，然后加入预热的邻苯三酚（对照管用10 mmol/L HCl代替），迅速摇匀，导入1 cm比色皿中，在327 nm处，每隔30 s测吸光度一次。表1. 测定邻苯三酚自氧化速率试剂用量表试剂50 mmol/L pH=8.2 Tris-HCl缓冲液45 mmol/L邻苯三酚 加入量（mL） 4.

10、5 0.01 最终浓度（mmol/L） 50 0.1总量 4.5 /（3）SOD或粗酶提取液的活性测定 按照表2加样，测定方法同上表2.测定SOD及粗酶活性的试剂用量表 试剂50 mmol/L pH=8.2 Tris-HCl缓冲液45 mmol/L 邻苯三酚SOD或粗酶 总量加入量（mL）4.5 0.01 0.01 0.01最终浓度（mmol/L）50 0.1 / /2结果与讨论2.1 实验结果表3.邻苯三酚的自氧化速率与酶活性测定结果编号 1 1 2 2 3 3 4 4 5 550 mmol/L pH=8.2 Tris-HCl缓冲液4.5 mL 4.5 mL 4.5 mL 4.5 mL 4.

11、5 mL 4.5 mL 4.5 mL 4.5 mL 4.5 mL 4.5 mL10 mmol/L HCl10 L / 10 L / 10 L / 10 L / / 10 L45 mmol/L 邻苯三酚/ 10 L / 10 L / 10 L / 10 L / 10 L10L酶 不加 不加 酶 1 酶 1 酶 2 酶2 酶 3 酶 3 酶 4 酶 4斜率 0.0950 0.0420 0.0254 0.0093 0.0059 0.0327（稀释后）单位体积活力（U/mL）= （0.07-样液速率）/0.070/50% *100 %*反应液总体积*（样液稀释倍数/样液体积） 总活力（U）=单位体积活

12、力（U/mL）*原液总体积按上面两式，根据斜率计算酶活力，得到结果如表4所示表4.酶的活力计算结果样品 邻苯三酚自氧化酶1 酶2 酶3 酶4自氧化速率（斜率）0.0950 0.0420 0.0254 0.0093 0.0059单位体积活力（U/mL）/ 502.1053 659.3684 811.8947 844.1053总活力（U）/ 150631.5789 98905.2632 8118.9474 8441.0526酶4稀释10倍后 0.03275902.1053 59021.0526表5.柱层析紫外吸收数据记录编号紫外吸收A1（4）编号紫外吸收A1（4）12346789101112130

13、.017 0.047 1.094 1.060 0.979 0.830 0.676 0.599 0.486 0.358 0.282 0.206 0.142 141516171819 /20 / / / / / / / / / / / / /紫外吸收A2（-20） 0.012 0.007 0.023 0.192 0.564 0.702 0.822 0.899 0.892 0.835 0.729 0.638 0.4870.102 0.701 0.055 0.053 0.051紫外吸收A2（-20） 0.373 0.290 0.226 0.192 0.147 0.129 0.110绘制淋洗曲线如图2所

14、示图2. 淋洗曲线表6柱层析后酶活性的测定结果样品 邻苯三酚2 3 4自氧化速率 自氧化速率（酶放置一天后再测定） 单位体积活力（U/mL） 总活力U（4mL） 0.1851 0.1326 0.1648 0.17210.1362 0.1377 0.1406 未测- 2552.6742 987.0340 632.0908- 10210.6969 3948.1361 2528.36302.2讨论1在猪血液里，Cu.Zn-SOD 与血红蛋白等共存于红血球。当红血球破裂溶血后，用氯仿-乙醇处理溶血液，使血红蛋白沉淀，而Cu.Zn-SOD 则留在水-乙醇均相溶液中。将磷酸氢二钾加入水-乙醇均相溶液中时，

15、由于其极易溶于水，而在乙醇中的溶解度甚低，溶液明显分层，上层是具有Cu.Zn-SOD 的含水乙醇相，下层是溶有磷酸氢二钾的水相（比重大）。用分液漏斗分出上层具有SOD 的含水乙醇相，再加入有机溶剂丙酮，使SOD 沉淀。极性有机溶剂能导致蛋白质脱去水化层，并降低介电常数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒凝集而沉淀。采用这种方法沉淀蛋白质时，要求在低温下操作，并尽量缩短处理时间，避免蛋白质变性。Cu.Zn-SOD的pI为4.95。将上一步收集的SOD 丙酮沉淀物溶于蒸馏水中，在pH7.6 的条件下，Cu.Zn-SOD 带负电，过DE-32 纤维素阴离子交换柱可得到进一步纯化。2.由于Cu（

16、OH）2在空气中长期放置，氧化性会显著降低，易和空气中的CO2形成碱式碳酸铜，因此，需要现用现制。3.在将共混液装入注射器后，应均匀用力推出成丝状的溶液。但由于注射器过大且溶液有一定黏度，在注射器前端套一枪头，再推出丝状溶液，高聚物熔体挤出物表面随 而依次出现粗糙、波纹、竹节甚至破裂现象。在酸洗过程中，尽量把颜色极深的、体积粗大的填料挑出，防止柱层析的效果不好。4.利用来源丰富且价廉的纤维素制备色谱柱填料不仅保护环境而且节约石油资源。从纤维素Ca(SCN)2 溶液，纤维素粘胶液，以及纤维素的17.5%NaOH水溶液已制备了各种SEC 柱填料。这些方法制得的填料，强度高，尺寸稳定性好，分辨率高。

17、但由于孔径太小，分级范围很窄，使实际应用受到了很大的限制。而采用聚乙二醇-2000（PEG2000）和纤维素铜氨溶液共混的方法，可制得强度很好的再生纤维素改性多孔膜，其孔径是未共混的纤维素膜的4 倍，达到400Å。纤维素共混膜在不同凝固条件下可形成多孔膜，而且其孔径可以通过加入的水溶性高分子的种类、分子量和含量进行控制。在此基础上，采用该体系已制备了系列多孔色谱柱填料，在水和有机溶剂体系中对多糖进行了成功的分级。这就是此实验中采用两种填料共混作为纤维素柱层析填料的原因。5.在提取过程中，酶的活力随着实验的进行逐步降低。酶2比酶1的活力显著降低，酶3号样的活力比酶2号样的活力也显著降低

18、，由此可以推测出，可能是氯仿、丙酮等有机溶剂的加入使酶的活力显著降低。在表3中可以看到，酶4的活力比酶3高，一方面，可能是因为透析前后酶的活力变化不大，测定本身也有误差，另一方面，可能是透析前的酶提取液含有少量杂质比如丙酮，对酶的活力有一定的抑制作用。酶4稀释10倍后测得的酶活力显著提高。分析原因为，在稀释前，酶对底物已经饱和，有一部分酶并没有真正发挥作用，但是我们却认为所有酶都参与进来了。而稀释后，充分发挥了酶的作用，所以测得的酶活力也相应提高。所以，在测定酶活力时，如果酶的浓度很高，应该稀释一定倍数后在进行测定才比较准确。5.从表5中数据可以看出，由于4条件下保存的酶在淋洗时，开始一部分泼

19、洒少量，所以采用-20条件下保存的酶淋洗的吸光度绘制淋洗曲线。6. 从表6中数据可以看出，第一次测定时邻苯三酚本身的自氧化速率偏大，根据酶2、3、4的斜率变化可初步推测，酶有活性。放置一天后，对酶再次测定，斜率基本稳定，推测酶完全失活。3结论本次实验制备了纤维素柱填料、并用其基本提纯了超氧化物歧化酶，其中酶的活性随着实验的进行逐步降低，加入丙酮以及长时间保存后，活性显著降低，但可以肯定，提取出来的超氧化物歧化酶是有活性的。致谢感谢田沺老师的悉心指导，感谢同组同学的合作帮助，感谢预备室老师为我们提供各种仪器和试剂。参考文献：1 武汉大学化学与分子科学学院实验中心.综合化学实验（第1版）M. 武汉：武汉大学出版社，2003，39-50。The centerof experiment of College of Chemistry and Molecular Science, Wuhan University, comprehensive chemical experiment,2003，39-50.Preparation and Purification of S