结直肠肿瘤TIMPs表达定量研究

1、    结直肠肿瘤TIMPs表达定量研究        摘要：目的探讨组织金属蛋白酶抑制物(TIMPs)表达与结、直肠癌转移的关系。方法用免疫组织化学的方法回顾性检测60例结、直肠肿瘤石蜡标本中TIMP-1，TIMP-2的表达。应用像分析的方法定量分析TIMP-1、TIMP-2在肿瘤组织及间质中的表达，并进一步探讨与肿瘤转移潜能之间的关系。结果TIMP-1在肿瘤细胞中表达高于间质(P<0.01)，同时肿瘤细胞TIMP-1表达高于TIMP-2(P<0.01)。无血管

2、转移组TIMP-2表达高于有血管转移组(P<0.01)。腺瘤组织TIMP-1、2表达均高于癌组织(P<0.01)。结论TIMPs在结直肠癌中的表达与抑制肿瘤转移相关。关键词：结直肠肿瘤；组织金属蛋白酶抑制物；肿瘤转移中分类号：R73-37文献标识码：A文章编号：1000-8578(2000)05-0380-03 Quantitative Analysis of Expression of TIMPs in Colorectal CancerCHEN Hua-jiang(Department of Oncology,Changzheng Hospital,Shanghai 20000

3、3,China)WANG Jie-jun(Department of Oncology,Changzheng Hospital,Shanghai 200003,China)HE Jin,et al(Department of Oncology,Changzheng Hospital,Shanghai 200003,China)Abstract:Objective To evaluate the relation between the expression of TIMPs and the metastasis of colorectal cancer.Methods Aretrospecti

4、ve review was made of the expression of TIMP-1，TIMP-2 in paraffin-embedded specimens form 45 patients with colorectal cancer using immunohistochemical method.And the expression of cancers? and the mesenchyma tissues? was analyzed respectively using an image quantification analysis system.Finally,the

5、 relationshop between the expression of TIMPs and the potential metastasis ability of colorectal cancer was analyzed.Results The expression of TIMP-1 in tumorous cells was significantly higher than that of in mesenchymal tissues(P<0.01) and than the expression of TIMP-2 in tumorous cells(P<0.0

6、1).The TIMP-2 expression of cancerous area was significantly higher in negative vessel involved group than that of vessel involved group(P<0.01).Furthermore,Both the TIMP-1 and TIMP-2 expressions of cancerous area were significantly higher in adenoma group than that of in cancer group(P<0.01).

7、Conclusions The expression of TIMPs was relative to metastasis of colorectal tumor.Key words：colorectal tumor;TIMPs;tumor metastasis肿瘤转移过程中细胞外基质(Extracelluar Matrix ECM)的降解是一个极重要的步骤。基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases MMPs)，是ECM降解过程中的重要酶类。在正常稳定状态的组织中MMPs表达量少。组织金属蛋白酶抑制物(Tissue inhibitors of metalloprot

8、einases TIMPs)是MMPs的天然抑制剂。MMPs-TIMPs之间的平衡关系丧失为肿瘤侵袭转移提供了一个重要的有利因素1。本文以像分析的方法定量分析60例结、直肠癌组织中TIMPs表达，并探讨其与浸润和转移潜能之间的关系。1材料与方法1.1对象收集19911994年上海长征医院和南京八一医院保存完好的结、直肠肿瘤石蜡包埋标本60例。全组平均年龄52岁(2575岁)，男36例，女24例，其中结肠癌28例、直肠癌24例、结肠腺癌8例。其中Dukes A期5例、B期28例、C期19例。由有经验的病理医师重新观察肿瘤的病理分型、分级、浸润深度、淋巴结转移、血管和淋巴管转移。1.2实验方法鼠抗

9、入TIMP-1、TIMP-2抗体购自美国Santa Cruze公司，稀释度1：100。免疫组化采用LSAB方法。显色剂为ACE。以PBS(pH7.4)替代一抗作为阴性对照。细胞出现红棕色颗粒为阳性细胞。像分析采用中科院HPIAS-1000高清晰度彩色病理文分析系统。先于低倍镜下(100×)分别选取4个阳性成分最密集的肿瘤区域和间质区域，然后在40×倍物镜下摄取像，分别测量每张切片的肿瘤细胞及间质阳性成分平均光密度(MOD)、肿瘤细胞及间质阳性成分相对面积(%)，然后以其积代表阳性成分相对含量(Relative Content RC)3，4。1.3统计方法判断TIMPs在肿瘤

10、和间质中表达的相互关系用Spearman双变量相关、Wlicoxon配对检验；判断TIMPs在各临床病理表现之间的关系用Kruskal Wallis test和Mann-Whitney test。2结果2.160例结直肠癌中腺癌级5例、腺癌级28例、腺癌级7例、粘液腺癌6例、印戒细胞癌6例、腺瘤8例。经病理学检查证实有淋巴结转移者(LN+)18例，无淋巴结转移者34例；有血管转移13例，无血管转移39例；有淋巴管转移23例，无淋巴管转移29例；局限于粘膜层5例，浸润肌层25例，浸润浆膜和浆膜外22例。2.2TIMP-1与TIMP-2的表达分布TIMP-1和TIMP-2均主要分布于肿瘤细胞的胞膜

11、和胞浆，以胞浆为主。两者在肿瘤细胞质中均可见孤立的棕红色阳性颗粒，分布于肿瘤细胞质的底部、中部和顶部。实验观察到瘤细胞向外分泌TIMP-2阳性颗粒的现象。间质中血管内皮细胞和少量单个核细胞可见TIMP-1、2阳染(如1)。1.A：癌细胞质TIMP-1阳染，可见有阳性颗粒位于胞质底部、中部及以顶部。(×200倍)B：癌细胞质TIMP-2阳染，棕红色阳性颗粒向腺腔分泌，右下腺腔坏死，有棕红色阳染物。间质少量散在阳性染色。(×100倍)2.3TIMPs像分析结果TIMPs在肿瘤组织中阳性成分表达情况如表1所示。统计表明：TIMP-1在癌细胞中表达高于癌间质(P<0.01)；

12、癌细胞TIMP-1表达高于TIMP-2(P<0.01)。Spearman相关分析表明：癌细胞TIMP-1与TIMP-2表达(r=0.8，P<0.01)、间质TIMP-1与TIMP-2表达(r=0.7 P<0.01)均极显著相关。TIMP-1、2在各病理类型之间表达强度不同，腺瘤瘤组织显著高于癌组织(P<0.01)。统计分析表明TIMPs与年龄、性别、肿瘤体积、浸润深度、淋巴管转移和淋巴结转移之间均无显著相关。无血管转移组肿瘤TIMP-2表达高于有血管转移组(P<0.01)。(见表2)表1结直肠肿瘤组织TIMPs表达(RC)癌细胞癌间质腺瘤细胞TIMP-13.27&

13、#177;2.95*1.54±1.49*8.22±0.27*TIMP-22.07±2.291.47±1.696.37±1.47*P<0.01 表2TIMPs在有无血管转移组间的表达(RC)癌血管转移组癌无血管转移组TIMP-11.59±2.563.03±2.82TIMP-20.37±0.43*2.13±2.13P<0.01 3讨论3.1TIMPs在肿瘤组织中的表达一些研究表明TIMP-1以肿瘤表达为主，TIMP-2以间质表达为主。如在头颈部癌、乳腺癌、肝细胞癌、膀胱癌中3-6。在小细胞肺癌中T

14、IMP-1、TIMP-2均主要表达于癌组织7。本组研究发现TIMP-1、TIMP-2在肿瘤与基质中均有表达，两者表达程度显著相关。TIMP-1在肿瘤细胞中表达高于间质中的表达(P<0.01)，同时肿瘤细胞表达TIMP-1较TIMP-2为多(P<0.01)，这一点与国外研究基本相同。然而，TIMP-2在肿瘤细胞和间质中的表达没有显著性差异。TIMP-1、TIMP-2在腺瘤组织中表达显著高于癌组织。提示TIMPs表达下降与肿瘤的恶性转化可能有关。3.2TIMPs与浸润转移的关系关于TIPMs与肿瘤侵袭与转移的关系已进行了广泛的研究。众多实验研究通过运用外源性的TIMPs、重组TIMPs

15、或直接对细胞TIMPs的基因表达进行调控，以下调MMPs的活性，并在体内或体外检则其抗肿瘤转移的活性。Thorgeirsson等8在体外人羊膜侵袭系统测定中发现，纯化外源性TIMP-1(10ug/ml)使FMLP诱导的M5076网状肉瘤细胞株侵袭能力下降450%，同期腹腔内注射皮下接种B16-F10黑色素瘤细胞的小鼠，发现其肺内转移率明显下降。Imren等9将表达TIMP-2基因的逆转录病毒载体与c-Ha-ras转化细胞共同注射裸鼠皮下，18天后观察肿瘤生长情况，发现与对照组(平均肿瘤体积4.1cm3)相比有明显缩小(平均直径为1.5cm3)。同时经切片HE及Masson三色染色发现，其肿瘤细

16、胞均未侵及肌层。连续切片可见肿瘤被一厚胶原纤维层包裹。相反，对照组肿瘤不仅侵及肌层同时还可见侵及腹腔。其他研究也发现，以TIMP-1、TIMP-2基因转染B16-F10黑色素瘤细胞、Ha-ras转化的鼠胚胎细胞、人胃癌细胞株、人星形细胞瘤细胞株等都可导致侵袭及转移潜能下降。本组实验通过免疫组化定量分析表明：TIMP-1、TIMP-2表达与年龄、性别、肿瘤体积、浸润深度、淋巴结和淋巴管转移无关。无血管腔转移组癌细胞TIMP-2表达显著高于血管转移组，而TIMP-1无显著差异。表明结直肠癌细胞TIMP-2表达增加对肿瘤血管转移有抑制作用。然而另有研究发现TIMPs表达与肿瘤的预后复发关系较密切。K

17、anayama等10以RTPCR法分析41例膀胱癌术后标本发现，在分级高于PT2(有肌层侵犯)的膀胱癌其MMP-2，TIMP-2表达水平均明显高于PT1级的肿瘤(P<0.005)。目前研究已经证实TIMPs在体内具有多方面作用如抑制新生血管形成、促进细胞生长、抑制凋亡。本组研究发现结直肠癌细胞有分泌TIMPs的现象，提示TIMPs可能在肿瘤局部微环境调节中有更为复杂的机制尚有待进一步研究。作者单位：陈华江（200003 上海，长征医院肿瘤科）王杰军（200003 上海，长征医院肿瘤科）何金（200003 上海，长征医院肿瘤科）贾绍昌（200003 上海，长征医院肿瘤科）刘会敏（20000

18、3 上海，长征医院肿瘤科）殷广福（200003 上海，长征医院肿瘤科）参考文献：1Kleiner DE,Stetler-stevenson WG.Matrix metalloproteinases and metastasisJ.Cancer Chemother Pharmacol,1999,43(suppl):s42-s51.2徐庆中，段会玲，卢德宏，等.星形细胞瘤的胶质纤维酸性蛋白和波形蛋白免疫组织化学定量研究J.中华病理学杂志，1994，23(2)：66-69.3Polette M.Clavel G,Biremnaut P,et al.Localization by in situ hy

19、bridization of mRNAs encoding stromelysin 3and tissue inhibitors of metallo-proteinases TIMP-1 and TIMP-2in human head and neck carcinomasJ.Path Res Pract,1993，189(9)：1052-1057.4Lindsay CK,Thorgeirsson UP,Tsuda H,et al.Expression of tissue inhibitor of metalloproteinase-1 and type IV collagenase/gel

20、atinase mRNAs in human breast cancerJ.Hum Pathol,1997,28(3):359-365.5Nakatsukasa H,Ashida K,Higashi T,et al.Cellular distribution of transcripts for tissue inhibitor of metalloproteinases 1 and 2 in human hepatocellular carcinomasJ.Hepatology,1996,24(1):82-88.6Grignon DJ,Sakr W,Toth M,et al.High levels of tissue inhibitor of metalloproteinase-2(TIMP-2) expression are associated with poor outcome in invasive bladder cancerJ.Cancer Res,1996,56(7):1654-1659.7Michael M,Babic B,Khokha R,et al.Expression and prognostic significance of metalloproteinases an