细胞生物学研究方法学时ppt课件

1、第二章第二章 细胞生物学研讨方法细胞生物学研讨方法 Chapter 2 Methods in Cell Biology Research Chapter 2 Methods in Cell Biology Research 细胞形状构造的察看方法细胞形状构造的察看方法 Methods for observing cell morphology and structures 细胞组分的分析方法细胞组分的分析方法 Methods for analyzing cell constituents 细胞培育、细胞工程细胞培育、细胞工程 Cell culture and cell engineering

2、细胞及生物大分子的动态变化细胞及生物大分子的动态变化 Dynamic analysis of biological macromolecules in cells 用于细胞生物学研讨的方式生物用于细胞生物学研讨的方式生物 Model organisms in cell biology 第一节第一节 细胞形状构造的察看方法细胞形状构造的察看方法各类细胞直径的比较 显微镜显微镜电子显微镜电子显微镜复式显微镜复式显微镜倒置相差显微镜倒置相差显微镜微分干涉显微镜微分干涉显微镜荧光显微镜荧光显微镜激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜 光学显微镜光学显微镜透射电子显微镜透射电子显微镜扫描电子显微镜扫描电子显微

3、镜 研讨用显微镜研讨用显微镜单式显微镜单式显微镜普通光学显微镜普通光学显微镜扫描隧道显微镜扫描隧道显微镜光学显微镜的分辨率光学显微镜的分辨率resolution of optical microscope分辨率分辨率(resolution)区分开两个质点间的最区分开两个质点间的最小间隔小间隔.对任何显微镜来说，最重要的性能参数是分辨率，而不是放大倍数。对任何显微镜来说，最重要的性能参数是分辨率，而不是放大倍数。普通光镜的最大分辨率是普通光镜的最大分辨率是0.2m。0.2um0.2um0.2nm0.2nm0.1nm0.1nm一、普通复式光学显微镜技术一、普通复式光学显微镜技术1 1、普通光学显微

4、镜、普通光学显微镜 light microscopelight microscope2、相差显微镜、相差显微镜 phase contrast microscope将透过标本的可见光的光程差变成振幅差，提高对比度，构造上的特殊之处：将透过标本的可见光的光程差变成振幅差，提高对比度，构造上的特殊之处：环形光阑环形光阑condenser annulus相位板相位板annular phase plate用途：可以察看未经染色的标本和活细胞用途：可以察看未经染色的标本和活细胞F. Zernike于于1935年发年发明并因此获明并因此获1953年诺年诺贝尔物理奖贝尔物理奖倒置相差显微镜倒置相差显微镜 in

5、verted phase contrast microscope物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，可以用于察看培育皿中后者在载物台之上，可以用于察看培育皿中的活细胞。的活细胞。3、微分干涉显微镜、微分干涉显微镜 differential interference contrast (DIC) microscope在相差显微镜原理的根底上，利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明在相差显微镜原理的根底上，利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显示构造的三维立体投影。与相差显微镜相比，立体感更强暗效果，能显示构造的三维立体投影。与

6、相差显微镜相比，立体感更强4、荧光显微镜、荧光显微镜 fluorescence microscope为落射式照明，即光源经过物镜投射于样品为落射式照明，即光源经过物镜投射于样品光源为波长较短的光，分辨力强光源为波长较短的光，分辨力强用于察看细胞组分特异发出的自然或标志荧光用于察看细胞组分特异发出的自然或标志荧光集多种功能于一体的集多种功能于一体的万能研讨显微镜万能研讨显微镜兼有明视野、相差、微分干涉、兼有明视野、相差、微分干涉、荧光、显微摄影等功能，是高级荧光、显微摄影等功能，是高级研讨仪器。研讨仪器。5、激光共聚焦扫描显微镜、激光共聚焦扫描显微镜 laser confocal scannin

7、g microscope 激光作光源；激光作光源； 经过检测器前小孔成像；经过检测器前小孔成像； 扫描激光聚焦点也是瞬时扫描激光聚焦点也是瞬时成像焦点成像焦点共聚焦。共聚焦。 分辨力为普通光镜的分辨力为普通光镜的1.4-1.7倍倍.Epi-fluoresceneConfocal荧光显微镜与扫描共焦显微镜的比较小鼠肾小球荧光显微镜与扫描共焦显微镜的比较小鼠肾小球Alexa Fluor 488 wheat germ agglutinin, a green-fluorescent lectin, was used to label elements of the glomeruli and conv

8、oluted tubules. The filamentous actin prevalent in glomeruli and the brush border were stained with red-fluorescent Alexa Fluor 568 phalloidin. The nuclei were counterstained with the blue-fluorescent DNA stain DAPI. Molecular Probes FluoCells prepared slide #3 (F24630)Zeiss Plan-Neofluor 40 x/1.30

9、OilZeiss C-Apochromat 40 x/1.1 W Corr荧光察看细胞构造荧光察看细胞构造细胞内的动态变化细胞内的动态变化FRETFRP鲁斯卡鲁斯卡(19061988)，德国物理学家，德国物理学家，1932年研制第一台电子显微镜，年研制第一台电子显微镜，1986年年获诺贝尔物理奖。获诺贝尔物理奖。二、电子显微镜技术二、电子显微镜技术 Electron microscopy Electron microscopy 1 1、光镜与电镜的主要区别、光镜与电镜的主要区别1光源不同光源不同: 可见光可见光/紫外线紫外线-电子束电子束 2透镜不同透镜不同: 玻璃玻璃-电磁透镜电磁透镜 3真

10、空真空 4显示记录系统显示记录系统 5分辨率分辨率: 0.2 um -0.2 nm1、透射电子显微镜、透射电子显微镜 transmission electron microscope, TEM透射式电子显微镜用于察看小于透射式电子显微镜用于察看小于0.2m的细微构造，称为亚显微构造的细微构造，称为亚显微构造submicroscopic structures或超微构造或超微构造ultramicroscopic structures.Figure 3-20. Electron micrograph of a root-tip cell stained with osmium and other h

11、eavy metal ions. 超薄切片制样技术超薄切片制样技术取材取材固定固定脱水脱水浸透、包埋浸透、包埋超薄切片超薄切片 厚度厚度40-50nm染色染色电镜的实践分辨率与切片厚电镜的实践分辨率与切片厚度有关度有关负染色技术负染色技术 Negative staining 负染色是用重金属盐对铺展在载网上的样品进负染色是用重金属盐对铺展在载网上的样品进展染色，吸去多余染料，样品经自然枯燥后，展染色，吸去多余染料，样品经自然枯燥后，整个载网上都铺上了一薄层重金属盐，从而烘整个载网上都铺上了一薄层重金属盐，从而烘托出样品的精细构造。托出样品的精细构造。 Figure 3-29. Electron

12、 micrograph of negatively stained actin filaments. Each filament is about 8 nm in diameter and is seen, on close inspection, to be composed of a helical chain of globular actin molecules. (Courtesy of Roger Craig.) 亦称冰冻断裂，主要用来察看膜断裂面的蛋白亦称冰冻断裂，主要用来察看膜断裂面的蛋白质颗粒和膜外表构造。质颗粒和膜外表构造。冷冻蚀刻电镜技术冷冻蚀刻电镜技术 Freeze E

13、tching electron microscopy2、扫描电子显微镜、扫描电子显微镜 scanning electron microscope, SEM20世纪世纪60年代问世，用来察看标本的外表构造年代问世，用来察看标本的外表构造目前扫描电镜的分辨力为目前扫描电镜的分辨力为 610 nm。Figure 3-23. Scanning electron microscopy. Scanning electron micrograph of the stereocilia projecting from a hair cell in the inner ear of a bullfrog (A)

14、. For comparison, the same structure is shown by differential-interference-contrast light microscopy (B) and by thin-section electron microscopy (C).三、扫描隧道显微镜三、扫描隧道显微镜 scanning tunneling microscope, STMBinnig和和Rohere 1981年发明，年发明，1986年获奖；年获奖；可察看到原子级的图像。可察看到原子级的图像。X-ray crystallography X射线衍射射线衍射B. NMR

15、 spectroscopy核磁共振成像核磁共振成像第二节第二节 细胞组分的分析方法细胞组分的分析方法一、用离心技术分别细胞器与生物大分子一、用离心技术分别细胞器与生物大分子普通离心机：转速普通离心机：转速25000 r/min超速离心机：超速离心机：30000 r/min在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分别不同大小的细胞和在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分别不同大小的细胞和细胞器细胞器 。1 1、差速离心、差速离心 differential centrifugationdifferential centrifugation细胞器沉降顺序：核、线粒体、溶酶体与过细胞器沉降

16、顺序：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体。氧化物酶体、内质网与高基体。2 2、密度梯度离心、密度梯度离心 density gradient centrifugation density gradient centrifugation 用介质在离心管内构成延续或不延续的密度梯度，细胞混悬液或匀浆置于用介质在离心管内构成延续或不延续的密度梯度，细胞混悬液或匀浆置于介质顶部，经过离心力场的作用使细胞分层、分别。介质顶部，经过离心力场的作用使细胞分层、分别。常用介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖常用介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖分为速度沉降分为速度沉降velocity sedimentation

17、和等密度沉降和等密度沉降equilibrium sedimentation 。其它生化分别方法其它生化分别方法纸色谱柱色谱亲和色谱Figure 3-42. SDS polyacrylamide-gel electrophoresis (SDS-PAGE).Figure 3-44. Separation of protein molecules by isoelectric focusing.Figure 3-45. Two-dimensional polyacrylamide-gel electrophoresis.二、细胞内核酸、蛋白质、糖等成分的显示方法二、细胞内核酸、蛋白质、糖等成分的显

18、示方法为了对某些细胞成分进展定性和定位研讨，利用染色剂可与细胞某种成分为了对某些细胞成分进展定性和定位研讨，利用染色剂可与细胞某种成分发生反响而着色的原理加以显示，称为组织化学和细胞化学染色方法发生反响而着色的原理加以显示，称为组织化学和细胞化学染色方法histochemical and cytochemical staining method；如：细胞内如：细胞内DNA和和RNA的原位显示的原位显示 Myofibrillar ATPase: Identifying Fast and Slow FibersSuccinate Dehydrogenase(琥珀脱氢酶): Identifying

19、Oxidati ve Potential Promoter:GUS是根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专注结合，对抗原进展定位测定的是根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专注结合，对抗原进展定位测定的技术，常用的标志物有荧光素和酶技术，常用的标志物有荧光素和酶免疫荧光法免疫荧光法immunofluorescent technique酶标免疫法酶标免疫法enzyme-labeled antibody method免疫细胞化学免疫细胞化学 immuno-cytochemistry二、细胞内特异蛋白质的定位和定性免疫荧光法免疫荧光法酶标免疫法酶标免疫法 利用分子探针检测细胞内特殊利用分子探针检测细胞内

20、特殊DNA序列、和序列、和RNA基因表达的方法。基因表达的方法。四、细胞内特异核酸序列的定位和定性原位杂交in situ hybridization人类染色体端粒人类染色体端粒DNADNA的荧光原位杂的荧光原位杂交照片交照片果蝇果蝇HBHB基因表达的原位杂交照基因表达的原位杂交照片片五、定量细胞化学分析技术对单个细胞进展快速定量分对单个细胞进展快速定量分析分选的一门技术；析分选的一门技术；流式细胞术 flow cytometry第三节第三节 细胞培育、细胞工程与显微操作技术细胞培育、细胞工程与显微操作技术活体或在体活体或在体(in vivo ) (in vivo ) 离体或体外离体或体外(in

21、 vitro ) (in vitro ) 细胞培育细胞培育 (cell culture) (cell culture) 就是选用最正确生存条件对活细胞进展培育和就是选用最正确生存条件对活细胞进展培育和研讨的技术；研讨的技术；原代培育原代培育 (primary culture)：从动物机体取出进展培育的细胞群。：从动物机体取出进展培育的细胞群。传代培育传代培育 (passage)：将细胞从一个培育瓶转移到另外一个培育瓶即称：将细胞从一个培育瓶转移到另外一个培育瓶即称为传代或传代培育。为传代或传代培育。细胞株细胞株 (cell strain) 和细胞系和细胞系(cell line)一、动物细胞培育

22、一、动物细胞培育cell culture二、植物细胞培育二、植物细胞培育组织培育组织培育 (tissue culture)：诱发产生愈伤组织，诱导再分化可培育出再生：诱发产生愈伤组织，诱导再分化可培育出再生植株植株 单倍体培育单倍体培育(haploid culture )：花药或花粉培育获得单倍体植株，人为加：花药或花粉培育获得单倍体植株，人为加倍后可得到完全纯合的个体倍后可得到完全纯合的个体原生质体培育原生质体培育(protoplast culture)：两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞交融两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞交融 (cell fusion

23、)或细胞杂交或细胞杂交 (cell hybridization)基因型一样的细胞交融称为同核体；来自不同基因型的杂交细胞称为异核基因型一样的细胞交融称为同核体；来自不同基因型的杂交细胞称为异核体；体；诱导方法：生物诱导方法：生物(病毒病毒)、化学、化学(PEG)、物理、物理(电激、激光电激、激光)。三、细胞工程三、细胞工程 细胞交融细胞交融单克隆抗体技术单克隆抗体技术 monoclonal antibody technique英国人英国人Kohler和和Milstein 1975年年将两种细胞杂交而创建了单克隆抗将两种细胞杂交而创建了单克隆抗体技术，获体技术，获1984年诺贝尔奖年诺贝尔奖显微

24、操作技术显微操作技术 micromanipulation technique第四节第四节 细胞及生物大分子的动态变化细胞及生物大分子的动态变化一、荧光漂白恢复一、荧光漂白恢复fluorescence photobleaching recovery, FRP技术技术荧光漂白恢复技术荧光漂白恢复技术(fluorescence recovery after (fluorescence recovery after photobleaching, FRAP)photobleaching, FRAP)二、荧光共振能量转移技术二、荧光共振能量转移技术fluorescence resonance energy transferfluorescence resonance energy transfer三、单分子技术三、