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文档简介
1、微生物的计数与活性污泥中生物相的观察一、实验原理利用血球计数板在显微镜下直接计数,是一种常用的微生物计方法。此 法的优点是直观、快速。此法计得的是活菌体和死菌体的总和,故又称为总 菌计数法。由于计数室的容积是一定的(0.1mm3),当含有细菌的溶液滴在 槽里时,通过水的表面张力扩散到计数室里,细菌也被分散到不同的格里, 通过计算不同的格里的细菌数, 最后就可以计算出, 溶液里所含的细菌数量。活性污泥中的生物相比较好照样,以细菌和原生动物为主,还有真菌、 后生动物等。在正常的成熟污泥中,细菌大多集中于菌胶团絮绒体中,游离 细菌较少,此时,污泥絮绒体可具有一定状、 稠密、扩光率强、 沉强性能好。
2、原生动物常作为污水净化指标;当固着型纤毛虫占优势时,一般认为污水处 理池运转失常;当后生动物轮虫等大量出现时,意味着污泥极度衰老。所以 可以通过观察原生动物,来评价活性污泥的状况,而且原生动物也较微生物 要大,容易观察。二、实验器材活性污泥样品、菌种:浓缩酵母菌液仪器:显微镜、血球计数板、盖玻片三、实验步骤1. 检查与清洗血球计数板:在正式计数之前,如果沾有杂质或菌体要用 95% 乙醇轻轻擦洗计数板的计数室,然后蒸馏水彻底清洗血球计数板,放在 显微镜下观察,调整好显微镜找到计数板刻度,检查有没有损坏。2. 加样:先将盖玻片放在计数室上,用吸管滴一滴已稀释好的菌液于盖玻 片边缘即是旁边的板槽里,
3、让菌液自行渗入,多余的菌液用滤纸吸去; 稍等片刻,待酵母细胞全部沉降到计数室底部,再进行计数。3. 计数:先在低倍镜下找到计数板的大格位置,然后将其移到视野中间, 然后转到高倍镜,适当调节光亮度,不能太亮,也不能太暗,然后将计 数室要计数的格子移到视野中进行计数。可以先用手机拍下,在手机里 进行点数,另一个人就可以继续移动计数板到另一计数区域,这样就可以更快、更轻松地完成计数。4. 计数:本实验用的是25*16 型的计数板,所以应该要选择左上,右上, 左下,右下,中间五个中格计数,如果有菌体落在双线上时,只计算一边,对应的另一边不算,对每个样品重复计数3次,取其平均值,按下列公式计算每毫升菌液
4、中所含酵母菌的细胞数。80小格内酵母菌细胞数酵母菌的细胞数 二80小格内酵母菌细胞数 40010000 稀释倍数805. 活性污泥的观察:将载玻片与盖玻片清洗干净,然后擦干。直接用吸管 吸取少量的活性污泥,滴一滴到载玻片中央,然后轻轻将盖玻片盖下, 削除气泡,多余的水用纸吸干,要尽量将污泥散开,形成薄薄的一层, 这样才有利用观察。转到40倍的物镜,调整好亮度后即可以观察。四、实验结果酵母菌细胞数的测定计算次数各大格中细胞数大格中细胞总数稀释倍数总细困数(个 /mL)左上右上左下右下中间第一次2934302628147201.47X108第二次2837302529146201.46X108第三次
5、3036282730149201.49X108平均值2936292629149201.49X108线虫轮虫红头飘体虫水雄虫钟虫聚缩虫独缩虫斜管虫变形虫累枝虫五、思考题1. 说明用血球计数板计数的误差主要来自哪些方面?应如何尽量减少误差,力求准确?误差主要来自于:原溶液误差:稀释倍数:稀释的大致范围是每个中格中的细菌数 1050个是比较理想的情况!如果太多,细菌可能会重叠,相互之间有影响;浓度太低,则 容易受到其他因素的干扰。仪器误差:计数板是否清洁干燥,计数板、盖玻片、微量吸管及刻度吸管的 规格应符合要求或经过校正,计数法最后的计数都是按照原定的板数据, 再加上 菌数来计算的,如果仪器本身出现
6、问题而不准确会造成很大的误差。操作误差:在滴溶液时操作不规范,溶液量滴得过多或过少都会对渗透的菌 数造成影响的,个人经验所得滴两滴是最适合的, 如果滴一滴则溶液太少了,连 槽都还没填满,不容易扩散到计数室里。一定不能多加,否则计数室内溶液量肯 定会超过计数所限制的0.1mm,每个小格里都有可能出现上下层的细菌数, 若出 现部分细菌看不清,无论怎么调都总有一部分细菌看清,则证明所加的量已经超 标了,出现了分层,此时应该清洗计数板,重新加液。2. 试述血球计数板的计数原理。 为什么用两种不同规格的计数板计数同一样 品,结果是一样的? 血球计数板是一种专门用于计算较大单细胞微生物的一种仪器, 由一块
7、比普 通载玻片厚的特制玻片制成的玻片中有四条下凹的槽, 构成三个平台。 中间的平 台较宽,其中间又被一短横槽隔为两半, 每半边上面刻有一个方格网。 方格网上 刻有 9 个大方格, 其中只有中间的一个大方格为计数室。 这一大方格的长和宽各 为1mm深度为0.1mm其容积为O.lmn3。在血球计数板上,一个大格分 400个 小格,每小格面积是 1/400 mm2。16X 25型:大方格内分为16中格,每一中格又分为25小格; 25X16型:大方格内分为25中格,每一中格又分为16小格。但是不管计数室是哪一种构造, 它们都有一个共同的特点, 即每一大方格都 是由 16X 25=25X 16=400
8、个小方格组成。所以每个小格的面积都是 1/400 mm216X25 型的计数板 :取四角: 1、4、13、16 四个中方格( 100个小方格) 计数,依下列公式计算:酵母细胞个数/ 1mL=100个小方格细胞总数/100 X 400X 10000X稀释倍数 25X 16型的计数板:计数四个角和中央的五个中方格(80个小方格)的细 胞数,依下列公式计算:酵母细胞个数/ 1mL= 80个小方格细胞总数/80 X 400X 10000X稀释倍数 由公式可以知, 实质计的是平均到每个小格的细菌数, 而两种型号的小格面 积都是一样的,所以计算出来的结果,排除掉误差因素,理念 上应该是一样的3. 根据实验
9、观察结果,试对活性污泥的质量及运行情况作初步评介。 实验观察到,活性污泥中出现了大量的飘体虫,中量的轮虫、累枝虫、独缩 虫和聚缩虫,还有少量钟虫、雄虫、线虫、变形虫和斜管虫。出现轮虫代表污泥处理效果好,但如果大量出现则表明污泥已经极度衰老, 出现污泥鼓胀。大量的飘体虫, 中量的轮虫、独缩虫和聚缩虫的出现都表明流动性污泥质量 好,运行情况和出水效果好。4. 请说说平板菌落计数法和比浊法的实验原理和实验步骤平板计数法:将行测样品经适当稀释后,其中的微生物充分分散成单个细胞, 取一定量的稀释样液接种到平板上,经过培养,由每个单眼细胞生长繁殖而形成 肉眼可见的菌落,即一个菌落应代表原样品中的一个细胞。
10、(1)将样品菌液稀释一系列的浓度梯度(2)将每个浓度的菌液涂布到三个平板上,然后培养一定时间(3)根据公式cfu二M N 5计算每个平板的菌落数,然后算每组浓度 三个平板的cfu平均值。cfu 每毫升中菌落形成单位;M同一稀释度3次重复的平均菌落数;N稀释倍数。通过涂布的溶液难以完全分散成单个细胞, 有些菌落可能是来自1个以上的 细胞,而且无法没到死细胞的数量,所以所测数值偏小,而且操作麻烦,耗时耗 材,但可以测到活细胞的数量;比浊法:细菌分布在溶液里,会对所照射的光进行吸收或反射、散射。所以 当用分光去照射溶液时,所能透过的分光会因为菌液浓度的不同而不同,此时细菌悬液的浓度与光密度(0D值成
11、正比,当与由已知菌落数的标准溶液所测的标 准曲线计算,就可以得出相应的菌落数。(1) 根据已知菌液浓度的标准液稀释成一系列浓度梯度的标准菌液,定容 到一定的体积;(2)将样品菌液稀释一定的浓度,定容一定的体积;(3)测标准菌液和样品菌液的Abs,然后根据由标准菌液所得的标准曲线 算出样品菌液的浓度。由于溶液里还有其物质会对紫外光有作用,例如细胞的残体、其他溶液物质、 杂质等等,所以所测数值会偏高,但方法简单,易操作,每个样品只要很短时间 就可以测出来。总结:微生物实验的核心就如老师第一节课所说的: 消毒灭菌、无菌操作、 纯种培 养。这三环是环环相扣的,贯穿整个微生物实验。从第一个实验: 培养基
12、的制备与空气中微生物的检测, 就要严格按照这三大 核心来进行实验了, 而第二个实验: 细菌的革兰氏染色与显微观察, 虽然没有以 上步骤,但那是因为这只是实验中的一个环节被我们单独出来了, 它所需要的菌 种也都是要经过以上的步骤的, 最后一个实验: 微生物的计数与活性污泥中生物 相的观察, 也是如此,总之只要是微生物实验就要涉及到微生物, 涉及到微生物 就必须要经历过三大步骤, 水中大肠菌群的检测法和土壤中四类微生物的分离纯 化,就要严格执行这三个步骤了,因为其他微生物的污染要严重影响实验结果, 甚至导致实验失败。对于准确性, 也严格测量所需要的试剂和样品的, 微生物就没有像监测之类 的那么严格了, 除非是做定量的分析, 可能就要比较严格了。 或许这也是我喜欢 做微生物实验之一微生物实验到此就完满结束了, 虽然所做的实验并不是很多, 但也学到不少 东西,而且老师的教学方式也是第一次遇到,实验并不是一点点按老师那样做, 而是要看自己的预习还有能力去完成, 对比起来这样才更像实验, 而且教学效果 比起大一大二的那些所谓实验要好很多,相比于工程班的效果也要好点。有次提前到实验室看到工班的同学还在
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