大肠杆菌表达的重组人BMP

1、大肠杆菌表达的重组人BMP             作者：王涛，陈苏民，陈南春，赵伟钦，张晓楠 【关键词】  重组人骨形成蛋白4成熟肽；重组人骨形成蛋白2成熟肽；发酵；蛋白质类/分离和提纯Comparison of largescale preparation of recombinant human BMP4 and BMP2 mature peptide expressed in E.coli【Abstract】 AIM: To prepare pure hum

2、an bone morphogenetic protein mature peptide (rhBMP4m and rhBMP2m)in large scale. METHODS: The rhBMP4m and rhBMP2m engineering strains were fermented and induced for expression in 15L NBS fermenter respectively and the bacterial cells were collected by centrifugation. Then the bacterial cells were l

3、yzed and the resulting inclusion bodies were washed for 4 times. After obtaining data from preexperiments, all inclusion  bodies were dissolved in 8 mol/L urea buffer and loaded on SPSepharose FF column. RESULTS: At the end of fermentation, A600 nm values of the two bacterial cultures were 28.8

4、 and 26.3. SDSPAGE analysis showed that rhBMP4m occupied 40% of the total bacterial proteins while that of rhBMP2m was 47.2%. rhBMP4m and rhBMP2m accounted for 82.9% and 84.5% of  the total proteins of the inclusion bodies respectively. After loaded on SPSepharose FF column, rhBMP4m and rhBMP2m

5、 were eluted out in 0.35  and 0.20 mol/L NaCl fractions and the purity reached 96% and 95% with the harvest of 1.30  and 1.25 g/L fermentation liquid and the recovery rate were 34.33% and 34.81%, respectively. CONCLUSION:  It could use the same fermentation program and the similar tec

6、hniques to prepare pure rhBMP4m and rhBMP2m in large scale.【Keywords】  recombinant human bone morphogenetic protein 4 mature peptide (rhBMP4m);  recombinant human bone morphogenetic protein 2 mature peptide (rhBMP2m);   fermentation; proteins/isolation purification【摘要】 目的： 大规模制备人

7、骨形成蛋白成熟肽（hBMPm）：hBMP4m和hBMP2m. 方法： 两种工程菌株分别含有能够高表达hBMP4m和hBMP2m的质粒，分别导入15 L NBS发酵罐中进行恒溶氧高密度发酵和诱导表达，离心收集菌体, 悬浮所收集的菌体，裂菌，洗涤4次. 预先取少量样品进行探索实验后，全部包涵体分别用8 mol/L尿素缓冲液溶解，上Sepharose SPFF阳离子柱. 结果： 发酵菌液A600 nm值分别为28.8和26.3. SOSPAGE电泳后吸光度扫描表明hBMP4m占细菌总蛋白量的40.0%, hBMP2m占细菌总蛋白量的47.2%. 洗涤4次后的包涵体中hBMP4m占蛋白量的82.9%,

8、 hBMP2m占蛋白量的84.5%. 上Sepharose SPFF阳离子柱后，分别收集0.35 mol/L NaCl和0.20 mol/L NaCl洗脱部分，获得纯度为96%的hBMP4m及纯度为95%的hBMP2m. 其收获量分别为1.30 g/L发酵液和1.25 g/L发酵液；收得率分别为34.33和34.81. 结论： 大规模制备hBMP4m和hBMP2m时，使用相同的发酵程序及相近的纯化方法，都能够得到较好的收得率、较高的收获量和纯度. 【关键词】  重组人骨形成蛋白4成熟肽；重组人骨形成蛋白2成熟肽；发酵；蛋白质类/分离和提纯0引言骨形成蛋白（bone morp

9、hogenetic protein, BMP）属于转化生长因子TGF超家族，是一类多功能的分化因子，构成一个结构和功能相似的家族，由于可以诱导异位成骨而被命名，是骨骼系统正常发育所必不可少的1. 而近年来的研究表明，BMPs在胚胎发生、神经系统发育及造血系统等方面也具有重要作用和广泛的临床应用前景2-3. 我们在大肠杆菌系统表达制备出有良好诱导成骨活性的人rhBMP2成熟肽（rhBMP2 mature peptide, rhBMP2m）4-5和用大肠杆菌系统表达制备有良好生物学活性的rhBMP4m6（国家专利申请号：200410073165.8）的基础上，使用已经构建好的高表达rhBMP4m和

10、rhBMP2m的大肠杆菌工程菌株4-6，用已比较成熟的制备rhBMP2m的流程，来比较两者大规模发酵、纯化的效果，旨在为rhBMP4m的大规模生产奠定基础.1材料和方法1.1材料工程菌株DH5/pDH2BMP4m和DH5/pDH2BMP2m由第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室构建并保存. 15 L全自动发酵罐购自美国NBS公司；Monitor UV1和 阳离子交换剂SPSepharose FF购自美国Pharmacia公司；玻璃层析柱购自上海锦华玻璃仪器厂，填料自装. 透析膜（截留分子量10 000）购自洛阳华美公司；超声细胞粉碎仪JY983购自宁波新芝科仪研究所；低温高速离心机购自

11、湖南湘西仪器仪表厂. 溶菌酶，DNAase购自美国 Invitrogen；去氧胆酸钠购自上海伯奥生物科技有限公司；TritonX为美国FARCO CHEMICAL产品；氯化镁，氯化钠，醋酸钠磷酸氢钠，磷酸二氢钠，尿素均为化学分析纯，购自天津化学试剂六厂和沈阳化学试剂厂；Brandfod蛋白定量试剂为本实验室配制；低分子量蛋白markers购自上海生化所. 1.2方法1.2.1rhBMP4m及rhBMP2m的高密度发酵取-70保存的DH5/pDH2hB4m及DH5/pDH2BMP2m工程菌株甘油菌种，划LB琼脂平板(含100 g Amp /mL)，32培养20 h. 分别挑单菌落入6

12、mL LB（含100 g Amp /mL）， 30摇床培养16 h. 转入300 mL LB(含100 g Amp /mL)，30摇床培养10 h. 转入15升发酵罐30培养，开启NBS数模转换器并连接计算机，由注入口向发酵罐内注入300 mL菌种（此步保持无菌操作），接装碱泵，启动自动控制程序，设定30生长16 h，自动恒定控制氧溶量，自动流加16.5 mol/L氨水使pH值保持在7.0左右，搅拌速度在200800转间受溶解氧的反馈调控，空气流速8 L/min，由溶解氧控制分批补料的培养. 生长16 h后取样观察发酵液密度，再升温42诱导培养4 h后，结束发酵. 1.2.2裂菌、包

13、涵体洗涤按每克湿菌加入3 mL裂解缓冲液(蔗糖100 g/L,  pH 8.0 TrisHCl 10 mmol/L, EDTA 1 mmol/L),洗涤液，彻底分散菌体，充分悬浮后，加溶菌酶3 mg/克湿菌，充分搅拌融解；加入0.1 mmol/L去氧胆酸钠充分搅匀，最后加入5 mg/mL DNasel搅匀，室温放置至黏度降低，4离心13.4 g，15 min，收取沉淀. 按每克湿沉淀加入3 mL洗涤液（TritonX100 5 g/L， pH 8.0 TrisHCl 10 mmol/L, EDTA1 mmol/L），彻底分散，充分悬浮，于冰浴中超声裂菌，4离心5.9 g，10 min

14、，收取沉淀. 再重复上述操作，共洗涤4次，最后收集蛋白沉淀. 1.2.3层析预实验取少量洗涤后的包涵体溶于8 mol/L尿素pH 6.5上样缓冲液(8 mol/L尿素，20 mmol/L磷酸钠缓冲液pH 6.5， 0.018 mmol/L巯基乙醇)中，上自行安装的小Sepharose SPFF柱，以含01 mol/L NaCl的上样缓冲液作连续线性梯度洗脱，收集不同盐浓度的洗脱蛋白峰进行电泳分析，探索得洗脱出目的蛋白时的NaCl浓度.  百事通 1.2.4Sepharose SPFF阳离子柱层析分离将洗涤后的包涵体溶解于适量 8 mol/L尿素pH 6.5上样缓冲液中，搅拌

15、至充分溶解， 20离心，13.4 g, 20 min. 收集上清液，过Sepharose SPFF阳离子柱，依照预试验结果用适当浓度的NaCl洗脱，将所得洗脱液做好标记后分别装入透析袋中对无离子水（pH 6.5）透析24 h，更换外液3次. 透析结束后，收集各透析袋内液，4离心，13.4 g, 20 min，将所得含目的蛋白的沉淀称重后20冻存. 2结果2.1rhBMP4m及rhBMP2m 42诱导表达4 h蛋白表达情况发酵结束后，取出全部发酵液，取样检测A600 nm值分别为 28.8和26.3.  SDSPAGE电泳分析，目的蛋白rhBMP4m及rhBMP2m分别占细菌总蛋白量的

16、40.0%和47.2%（图1）. 蛋白质定量后测算rhBMP4m和rhBMP2m发酵液量分别为3.6 g/L和4.1 g/L. 发酵液经4离心，5.9 g， 20 min，收得的菌体湿质量分别为320 g和282.44 g.A：DH5/pDH2hB4m；B： DH5/pDH2hB2m. M： 低分子量蛋白markers; 1： 诱导4 h; 2： 未诱导. 图1发酵液诱导表达4 h后SDSPAGE电泳图（略）2.2裂菌、包涵体洗涤结果收集所得包涵体沉淀，分别取样作SDSPAGE分析. 结果显示，目的蛋白（rhBMP4m及rhBMP2m）分别占细菌总蛋白量的82.9%和84.5%，计算洗涤后所得

17、目的蛋白总量分别为3.32 g/L及3.55 g/L发酵液（图2）.2.3Sepharose SPFF阳离子柱层析分离收集rhBMP4m及rhBMP2m的洗脱峰，分别取沉淀样品，作SDSPAGE分析. 结果显示，rhBMP4m纯度为96%，收获量为1.24 g/L发酵液；rhBMP2m纯度为95%，收获量为1.43 g/L发酵液. 以高密度发酵诱导表达4 h后的发酵液中目的蛋白含量为起点计算目的蛋白收获率，其rhBMP4m收获率为34.33%，rhBMP2m收获率为34.81%（图3）.A： pDH2hB4m;B： pDH2hB2m. 0: 洗涤前的样品；M： 低分子量蛋白markers;1:

18、 洗涤1次后；2： 洗涤2次后；3： 洗涤3次后；4： 洗涤4次后.  图2包涵体各次洗涤后样品的SDSPAGE电泳图（略）A： rhBMP4m;B：rhBMP2m. 1: 上柱前样品；M: 低分子量蛋白markers;2:  目的蛋白洗脱峰液.图3Sepharose SPFF柱层析目的蛋白洗脱峰液电泳图（略）3讨论BMP2和BMP4是BMP家族中的两个重要成员，其氨基酸序列有86%的同源性且活性形式均为二聚体，决定了其性质和功能的相似性. 基于这些特性，我们使用了相同的发酵、纯化方法来大规模制备这两种蛋白并得到了较为接近的结果4,6. 我们选择由本组构建的温度诱

19、导型、非融合蛋白表达载体pDH2来构建这两个工程菌株，是考虑到避免残留化学诱导剂对人体的损害和融合蛋白带来的免疫源性；用pDH2表达多种蛋白质表达水平又都比较高而且稳定. 在发酵阶段，诱导4 h后目的蛋白rhBMP4m和rhBMP2m分别占细菌总蛋白量的40.0%和47.2%，相差不大，可能的原因是：同一种载体表达两种性质和大小接近的蛋白（rhBMP4m为13.1 ku，rhBMP2m为12.9 ku），发酵过程中设置程序都是相同的，又采用相同的诱导条件，因而出现相似的表达. 在包涵体洗涤阶段，我们虽然使用了裂解缓冲液及溶菌酶并用去氧胆酸钠充分破裂细菌的壁和膜，加入DNase I消化

20、核酸降低黏度等，尽量使悬浮洗涤充分. 然而在大规模制备操作时，这些还不足以裂解所有细菌，因此需要再加入洗涤液重新彻底分散悬浮和裂菌. 由图2可见，随着洗涤次数的增加，杂蛋白条带减少了许多. 包涵体洗涤后，首选的是用阳离子交换柱层析. 与预期的一致，穿过峰很高，穿过峰液的A260 nm/A280 nm的比值接近2，表明不吸附在Sepharose SPFF柱上而被除去的，除了许多杂蛋白外还有不少的核苷酸类的物质（包括RNA和酶解的DNA小片段），SDSPAGE分析表明其中不含目的蛋白. 如果先用阴离子交换柱，柱体积中将有相当大部分被这些带负电荷的核苷酸类物质所占据，因而就要用大容积的阴离子交换柱，这在大规模分离中是很不利的. 先用阳离子交换柱就可以用小得多的离子交换柱. 从我们的实验中也可以看到用阳离子交换柱层析得到很好的结果，一步层析获得的rhBMP4m和rhBMP2m的纯度就分别达到96%和95%. 上述实验结果表明：本来用于大规模纯化rhBMP2m的流程也基本能够用于大规模纯化rhBMP4m. 使用相同的发酵程序及相似的纯化方法，都能够在大规模制备rhBMP4m和rhBMP2m时，得到较好的收得率、较高的收获量和纯度. 这就为rhBMP4m的大量生产、供给和使用打下了基础.【参考文献】1  Woz