嗜肺军团菌ip基因的克隆及其原核表达

1、嗜肺军团菌ip基因的克隆及其原核表达 11-03-20 14:44:00 作者：杨志伟，曹秀琴编辑：studa20【摘要】 目的 克隆嗜肺军团菌主要免疫原蛋白ip 基因, 构建重组质粒pET-ip,并在原核系统中表达。方法 采用聚合酶链反应(PCR)， 从嗜肺军团菌基因组DNA 中扩增军团菌主要免疫原蛋白ip 基因 ,并将其定向克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建原核表达重组质粒pET- ip,经限制性内切酶鉴定、PCR及测序分析后,转化宿主菌大肠杆菌BL21, IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE 电泳、免疫印迹分析鉴定。结果 扩增出了792 bp 完整的ip 基因,构建的原核

2、表达重组质粒pET- ip 表达出49 kDa Trx-IP的融合蛋白质，Westernblot 证实获得蛋白为所需要的目的蛋白。结论 成功构建了军团菌ip 基因的原核表达载体, 并在大肠杆菌中得到了高效表达。 【关键词】 军团菌;ip基因;克隆;基因表达Abstract: Objective To clone the ip gene of Legionella pneumophila, to construct recombinant plasmid and to detect its expression in prokaryotic cell. Methods The ip gene w

3、as amplified from the genomic DNA of Legionella pneumophila with PCR, and then was inserted into the prokaryotic expression vector pET32a(+).The prokaryotic expression recombinant plasmid pETip was constructed.After identification with restriction enzyme analysis, PCR and nucleotide sequencing analy

4、sis, the E. coli BL21 containing the recombinant plasmid pETip was induced with IPTG. The expression of ip was subsequently detected by SDSpolyacrylamine gel electrophoresis and Westernblot analysis. Results The ip gene of 792 bp long was amplified and the recombinant plasmid pETip was constructed.

5、SDSPAGE analysis showed that the Trx IP fusion protein of approximately 49 kDa in size was expressed. The expressed proteins could be confirmed by western blot. Conclusion The prokaryotic expression recombinant plasmid pETip was constructed successfully and its expressed efficiently in E. coli.Key w

6、ords：legionella pneumophila；ip gene；clone； gene expression嗜肺军团菌是引起军团病的主要病原体，通过空气传播，进入呼吸道的病原体在肺泡上皮细胞和单核巨噬细胞内增殖而发病。随着人们生活水平的提高，其危害性日益受到关注，目前尚无理想的防治措施，研制有效的军团菌疫苗是十分必要。嗜肺军团菌主要免疫原基因ip编码产生的29kDa外膜蛋白（29 kDa immunogenic protein，IP）1，为嗜肺军团菌110血清型所共有，具有种特异性，是机体免疫应答反应的主要免疫原。生物信息学分析显示其含有丰富的B细胞、T细胞表位，具有高度保守性，故选i

7、p 基因为构建DNA疫苗抗原候选基因。本研究通过PCR扩增获得嗜肺军团菌ip基因，将其定向克隆入原核克隆载体pET-32a(+)，构建重组质粒pET-ip，经鉴定后,并使ip基因在原核系统中得到表达，为进一步研究IP蛋白的结构、功能及其免疫原性和保护性功能等奠定基础。1 材料和方法1.1 材料 嗜肺军团菌L1标准株及相应兔血清抗体由中国疾病预防控制中心传染病控制所惠赠。克隆宿主大肠杆菌DH5a，质粒pET-32a(+)均由本室保存；限制性内切酶 Hind 和BamH 购自TOYOBO,NEB T4DNA连接酶购自基因生物技术有限公司，辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(H+L)及浓缩型DAB试剂盒

8、购自北京中杉金桥生物技术有限公司。1.2 方法1.2.1 嗜肺军团菌ip基因的PCR扩增接种嗜肺军团菌L1于BCYE-a琼脂培养基，37烛缸法培养5 d左右，收获细菌,提取其基因组DNA2。根据文献报道的ip基因序列1，自行设计合成扩增军团菌ip基因的引物，分别在5 端加上限制性核酸内切酶Hind 和BamH，引物序列如下：ip的上游引物(P1):5-GGAAGATCTAAGCTT ATGGGAGGTTCAATGAG -3,ip下游引物(P2): 5-TTAATAAGC GGATCC TTACCAGGCTGGTATTG- 3。 配制50 L PCR扩增体系：Ex Taq premix 25 L

9、， Primer P1（50 pmol/L）1 L，Primer P2（50 pmol/L）1 L，基因组DNA 1 L，灭菌蒸馏水22 L。PCR扩增设阴性对照，1 L灭菌蒸馏水代替模板DNA建立扩增体系。扩增条件：94预变性5 min；94变性 30 s，52 退火45 s，72 延伸60 s，30个循环；最后72延伸5 min。反应结束后取3 L扩增产物，用1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测。1.2.2 原核表达重组质粒pET-ip构建及鉴定分别将限制性核酸内切酶Hind 和BamH 消化PCR扩增的ip基因和载体pET-32a(+)适当比例混合，T4 DNA连接酶16连接过夜，转化200 L

10、 感受态DH5a，37过夜培养，随机挑取单个菌落接种于5 mL含氨苄青霉素（60 mg/L）的LB培养液，增菌后以碱裂解法小量提取质粒,随后对所提质粒采用引物P1、P2进行PCR扩增及用限制性内切酶Hind 和BamH 进行单、双酶切鉴定。1.2.3 基因序列测定取酶切及PCR鉴定阳性重组质粒的细菌，菌液送上海英骏生物技术有限公司，用通用引物对重组质粒pET-ip进行反向测序，对其进一步鉴定。1.2.4 pilE基因的诱导表达将pET-32a(+)和pET-ip质粒转化到BL21细菌中，接种于5 mL含氨苄青霉素（60 mg/L）的LB培养液，培养至对数期(A550=0.6)，经终浓度为1.0

11、 mM的IPTG诱导，收集诱导0、1、2、4、6h的培养物，制备蛋白样品，经10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶进行固定、考马斯亮蓝染色、脱色，拍照保存结果。1.2.5 Western blot分析取适量诱导不同时间的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分离，浸渍转印法将蛋白条带转移至硝酸纤维素膜上，将膜4过夜封闭，洗膜，与11000稀释的兔血清（一抗）4过夜，再次洗膜，与15000稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体(二抗)37 孵育1 h，DAB显色试剂盒显色，拍照保存结果。2 结果2.1 嗜肺军团菌ip基因的PCR扩增 用引物P1、P2对嗜肺军团菌L1基因组DNA进行PCR扩增，1.0% 琼

12、脂糖凝胶电泳分析，结果扩得一条约790 bp预期大小的产物条带；阴性对照无产物条带（图1）。2.2 pET-ip的PCR及限制性酶切鉴定结果 用引物P1、P2对所构建的重组质粒pET-ip进行PCR扩增，得到一条约790bp的预期条带；用限制性内切酶Hind 对所获得重组质粒pET-ip 进行单酶切分析，电泳结果显示有对应约6690bp的条带出现；用Hind 和BamH双酶切分析，同一泳道可见约5900bp和约790bp的两个条带出现，分别与pET-32a(+)空质粒和ip基因大小一致（图2）。2.3 ip基因序列测定结果 测序结果提交GenBank进行Blast比对分析。pET-ip测序结果

13、显示与嗜肺军团菌L1的ip 基因具有98%的同源性，12个碱基位点发生突变(第48位C-T，第52位G-A，第138位A-G，第228位C-T，第231位T-G，第273位A-T，第357位A-T，第382位A-C，第405位A-T，第552位A-G，第612位T-C，第678位C-A)，2个氨基酸位点发生改变(第18位V-I，第128位I-L)，两个氨基酸都是同类氨基酸的相互替代，对蛋白质的空间结构和功能没有大的影响，基本上未影响抗原决定基。利用NCBI的ORF finder 查找ip 基因阅读框架，含完整ORF(open reading frame)，起始密码和终止密码，ip基因片段长为7

14、92bp，共编码263个氨基酸，推测相对分子质量约为29 kDa。2.4 表达蛋白的SDS-PAGE检测 在SDS-PAGE凝胶电泳图上，经IPTG诱导，pET-ip的宿主菌蛋白样品在约49 kDa(标签Trx.Tag蛋白与IP蛋白形成的融合蛋白)处明显出现一条较浓重的条带；pET-32a(+)的宿主菌蛋白样品在约20 kDa处明显出现一条较浓重的Trx.Tag条带，而未诱导样品均未见相应特异条带(图3)。2.5 Western-blot鉴定结果 含有重组质粒pET-ip的BL21经IPTG诱导表达的产物在约49 kDa处出现一条特异性条带；而含有pET-32a(+)的BL21诱导表达产物未检

15、测到特异性杂交信号(图4)。3 讨论 29 kDa蛋白是嗜肺军团菌的主要外膜蛋白，也是嗜肺军团菌含量最多的蛋白3。蛋白免疫印迹检查结果表明，嗜肺军团菌110血清型感染患者的血清，均与29 kDa蛋白抗原反应，呈阳性反应的血清用大肠埃希氏菌细胞吸收后，并不能消除29 kDa蛋白反应；用嗜肺军团菌1型菌细胞吸收后的阳性血清能消除29 kDa蛋白反应4。用直接免疫荧光法检测结果显示，嗜肺军团菌1型29 kDa蛋白的单克隆抗体能与嗜肺军团菌1-10型发生反应，其阳性率为100%，与米克戴德军团菌、约旦军团菌、瓦茨沃斯军团菌、伯明翰军团菌、长滩军团菌均不发生反应，与肺炎链球菌、流感嗜血杆菌也不发生反应。1-1