平肝潜阳法对高血压模型大鼠下丘脑蛋白质表达的影响

1、平肝潜阳法对高血压模型大鼠下丘脑蛋白质表达的影响         09-02-07 16:27:00     作者：张莺 陈泽奇 钟广伟    编辑：studa20【摘要】  【目的】 观察平肝潜阳法对高血压肝阳上亢证模型大鼠下丘脑蛋白质表达差异的影响，从蛋白质组学水平探讨其降血压和改善肝阳上亢证症状的分子机制。【方法】选用自发性高血压大鼠（SHR）灌服附子汤法复制高血压肝阳上亢证大鼠模型，以大鼠作正常对照，治疗组给予天麻钩藤

2、饮加减方灌胃给药（0.1g/mL）；采用二维凝胶电泳（2DE）分离大鼠下丘脑蛋白质，获得差异表达蛋白质；利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDITOFMS）和数据库分析鉴定差异表达蛋白质。【结果】 高血压肝阳上亢证大鼠模型复制成功，其易激惹程度、饮水量、收缩压等与正常组比较，差异均有显著性意义（.）；治疗组给予中药天麻钩藤饮加减方治疗后，易激惹程度好转，饮水量减少，收缩压下降，与模型组比较差异均有显著性意义（.）。肝阳上亢模型组蛋白质图谱中有5个蛋白质斑点，与正常组比较表达上升2倍及以上，且同一点在平肝潜阳法治疗组中表达下降2倍及以上；有10个蛋白质斑点表达下降2倍及以上，且同一点在平

3、肝潜阳法治疗组中表达上升2倍及以上。【结论】 平肝潜阳法治疗高血压肝阳上亢证的作用可能与下丘脑某些蛋白质的改变有关。 【关键词】  高血压中药疗法 平肝潜阳法 蛋白质组学 疾病模型 动物 大鼠原发性高血压病（essential hypertension，EH）是一种常见的心血管系统疾病，具有发病率高、并发症多的特点。流行病学研究提示人群高血压病患病率较10年前明显增高1。长期高血压病极易导致心、脑、肾等脏器的器质性病变和功能损害，并最终导致这些器官的功能衰竭。肝阳上亢证是高血压病中的常见证型，据统计在高血压病中约占 87.33%2。平肝潜阳法是治疗高血压病肝阳上亢证的传统治法，不仅能

4、有效降低患者的血压水平，还可改善患者的生存质量，降低并发症的发生，已有研究从分子、基因等水平探讨其作用机制，取得了有意义的进展3。为了进一步从蛋白质水平探讨其作用机制，我们应用差异蛋白质组技术，观察了平肝潜阳法治疗高血压肝阳上亢证大鼠前后下丘脑蛋白质表达谱的变化，现报道如下。    1  材料与方法1.1  动物  正常健康Sprague Dawley（SD）雄性大鼠10只，清洁级，8周龄，体质量（200±10）g，由中南大学湘雅医学院实验动物部提供（医动字第20010 号）；自发性高血压大鼠（SHR）20只，雄性，清洁级，

5、8周龄，体质量（200±10）g，由上海斯莱克公司提供许可证号：SCXK（沪）20030003。1.2  药物制备  附子汤由 60g 单味制附子（由中南大学湘雅医院中药房提供）组成，先将药物浸泡 30 min，煎煮次后再将药液合并浓缩为含生药 0.1 g/mL。天麻钩藤饮加减方：天麻 10g，钩藤 20 g，石决明 30 g，牡蛎 30 g，牛膝 10 g，均由中南大学湘雅医院中药房提供。石决明先煎 20 min，钩藤后下，煎煮次后再将药液合并浓缩为含生药0.1 g/mL。1.3  主要试剂与仪器  2DQuantKit蛋白质定量试剂盒、固相

6、pH梯度干胶条（IPGstrip pH310L，24cm）、IPG Buffer （PH310L）、覆盖液均由Amershan Biosciences公司提供；二硫苏糖醇（DTT）、丙烯酰胺、甘氨酸、苯甲基磺酸氟（PMSF）、3（3胆酰胺丙基）二乙胺丙磺酸（CHAPS）、十二烷基硫酸钠（SDS）、NNNN四甲基乙二胺（TEMED）、考马斯亮蓝、琼脂糖均由Sigma公司提供；低分子量标准蛋白质由上海伯奥生物制品公司提供；Trisbase为USB公司分装；碘乙酰胺购自Fluka公司。Ettan IPGphor等电聚焦仪、Ettan DALTSystem垂直电泳槽（Amersham公司）；PDQue

7、st 7.0分析软件（BioRad公司）；Imagescanner扫描仪（Sigma公司）；Elx800自动酶标仪（BilTek Instruments，Inc）；真空冷冻抽干仪（avant公司）；4307MALDITOFMS质谱仪（ABI公司）；二道生理记录仪（成都仪器厂）；清醒小动物血压测量器（中南大学湘雅医学院心脏生理研究室）。1.4  分组与造模  正常组SD大鼠10只；治疗组及模型组大鼠各只，完全随机（随机排列表法）分组。正常组大鼠连续灌服蒸馏水 42d，于第 43天处死。治疗组及模型组参照鄢东红等4的方法，连续灌服附子汤共 21d，复制高血压肝阳上亢证模型；自第

8、 22 天起模型组改为连续灌服蒸馏水 21d，治疗组在同一时间灌服天麻钩藤饮加减方，均于第 43天处死。模型复制成功的标准参照鄢东红等4的方法，观察大鼠的外观及易激惹程度、饮水量、血压的变化（造模前，第3周末，第6周末）。血压测定采用杨绿化等5的尾动脉搏动法。各组动物腹腔注射水合氯醛麻醉，快速断头处死，冰上剥离下丘脑，装在标记好的冻存管后放在液氮中保存备用。1.5  二维凝胶电泳（2DE）分离和分析1.5.1  蛋白质双向电泳分离  采用2DQuantKit蛋白质定量试剂盒的微量测试法测定总蛋白质浓度，蛋白质定量采用Bradford法6。蛋白质双向电泳参考IPGh

9、orTM等电聚焦系统操作指南进行。参照文献7进行考马斯亮蓝染色。1.5.2  凝胶图像分析  采用Image Scanner扫描仪及LabScan扫描软件进行扫描，获取图像。以PDQuest 7.0分析软件进行图像分析。参照文献8，将蛋白质表达水平上升或下降200%的点选择为目标点进行鉴定。1.6  差异蛋白质点的质谱分析和数据库检测1.6.1  蛋白质的胶内酶解  切取差异表达蛋白质斑点，经水洗、脱色处理后，参照Fernandez J等9的方法并加以改进进行蛋白质的胶内酶解和萃取，获得蛋白质肽混合样品。1.6.2  基质辅助激光解吸

10、电离飞行时间质谱 （MALDITOFMS）检测  肽段样品采用MALDITOFMS检测，获得的混合物肽片段质量指纹图谱在Swissprot数据库搜索进行蛋白鉴定。1.7  统计学处理  使用SPSS 13.0软件包进行统计学分析。    2  结果2.1  大鼠外观及易激惹程度变化  模型组、治疗组大鼠在附子汤灌胃3周后，其易激惹程度发生了变化，多表现为级，且大部分出现了眼结合膜充血，与正常组比较，差异有显著性意义（.）；治疗组经中药天麻钩藤饮加减方治疗后（第6周末），其易激惹程度及眼结合膜充血均较前好转

11、，易激惹程度多表现为、级，眼结合膜充血大鼠数亦较前减少，与治疗前比较差异均有显著性意义（.）。结果见表1。2.2  大鼠饮水量变化  模型组、治疗组在附子汤灌胃3周后，饮水量均较造模前增加，与正常组及造模前比较差异有显著性意义（.）；治疗组经天麻钩藤饮加减方治疗后，饮水量较治疗前及模型组显著减少（.），与正常组接近（.）。结果见表2。2.3  大鼠血压动态变化  模型组、治疗组在附子汤灌胃3周后，其收缩压均较造模前提高，与造模前及正常组比较差异有显著性意义（.）；治疗组经中药天麻钩藤饮加减方治疗后，收缩压均较治疗前下降，与模型组及治疗前比较，差异均有显著

12、性意义（.）；但与造模前比较，差异无显著性意义（.）。结果见表3。2.4  各组大鼠下丘脑蛋白质双向电泳（2DE）图谱  电泳图谱经考马斯亮蓝染色，Image Scanner扫描后，用PDQuest 7.0分析软件可以检测到每组总蛋白质分布模式非常相似，且重复性好，每组约有700个左右的蛋白质斑点，以PI 48和Mr 2 00075 000范围的蛋白质斑点分布最多。结果见图1。2.5  各组差异表达蛋白  与正常组比较，模型组图谱中有5个蛋白质斑点表达上升2倍及以上，且同一点在治疗组中表达下降2倍及以上，大致处于与正常组同一水平，有的点甚至较正常组低2倍

13、或以上；有10个蛋白质斑点表达下降2倍及以上，且同一点在治疗组中表达上升2倍及以上，大致处于与正常组同一水平，有的点甚至较正常组高2倍或以上。结果见图2。2.6  质谱结果  对13个差异显示蛋白质斑点进行胶内酶切，MALDITOFMS测定肽质量指纹谱，在网站上利用MASCOT软件检索Swissprot蛋白质数据库进行鉴定，共鉴定出 8 个蛋白，另外5个蛋白斑点由于没有得到令人满意的肽质指纹图谱或搜索数据库时不能得到可信度较高的结果而未能鉴定。其中细胞质苹果酸脱氢酶、转导蛋白亚单位同系蛋白、甘油醛3磷酸脱氢酶在模型组表达较正常组上调，而治疗组重新下调至治疗前水平；线粒体异柠

14、檬酸脱氢酶亚单位前体、谷氨酰胺合成酶、蛋白酶体亚单位、磷酸甘油酸变位酶1、果糖二磷酸醛缩酶C在模型组表达较正常组下调，而治疗组重新上调至治疗前水平。    鉴定蛋白相关信息见表4。    表1  各组大鼠外观及易激惹程度变化比较（略）Table 1  Comparison of macroscope features and irritation degree in different groups统计方法：t检验；.，.，与正常组比较；.，与模型组比较；.，与同组第3周末比较表2   各组大鼠

15、饮水量变化比较（略）Table 2  Comparison of intake water volume in different groups统计方法：t检验；.，与正常组比较；.，与模型组比较；.，与造模前比较；.，与同组第3周末比较表3  各组大鼠血压动态变化比较（略）Table 3  Comparison of dynamic changes of blood pressure in different groups统计方法：t检验；.，与正常组比较；.，与模型组比较；.，与造模前比较；.，与同组第3周末比较表4  治疗后差异表达蛋白（略）Table 4  The differential expressed proteins