课题3 血红蛋白的提取和分离

1、下面请看一条新闻下面请看一条新闻 英国英国自然自然杂志登论文说，杂志登论文说，“”蛋白质蛋白质可有效抑制艾滋病病毒的感染。可有效抑制艾滋病病毒的感染。 此后，世界各地的很多科学家开始研究此后，世界各地的很多科学家开始研究“”蛋白质的结构，但到目前为止蛋白质的结构，但到目前为止尚未有人宣称取得突破性进展。尚未有人宣称取得突破性进展。提问提问研究研究“TRIM5”TRIM5”蛋白质蛋白质的第一步是什么？的第一步是什么？分离和提纯分离和提纯TRIM5TRIM5蛋白质。蛋白质。回答回答 根据蛋白质各种特性的差异，如根据蛋白质各种特性的差异，如分子分子的形状和大小的形状和大小、所带电荷的性质和多少所带电

2、荷的性质和多少、溶解度溶解度、吸附的性质吸附的性质、对其他分子的亲和对其他分子的亲和力力等等，可以用来分离不同蛋白质。等等，可以用来分离不同蛋白质。专题五专题五 DNA和蛋白质技术和蛋白质技术 1.了解色谱法、电泳法等分离生物大分了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。子的基本原理。 2.掌握蛋白质提取的基本概念。掌握蛋白质提取的基本概念。 1.学习对血液中蛋白质提取和分离的学习对血液中蛋白质提取和分离的方法。方法。 2.掌握从复杂提取中提取生物大分子掌握从复杂提取中提取生物大分子的基本过程和方法。的基本过程和方法。 本实验采取实验与课本相结合的方本实验采取实验与课本相结合的方法，在实验

3、中掌握分离大分子物质的基法，在实验中掌握分离大分子物质的基本方法。本方法。 1.发挥学生主观能动性。发挥学生主观能动性。 2.激发学生学习兴趣，培养学会僧激发学生学习兴趣，培养学会僧创新能力。创新能力。凝胶色谱法的原理和方法。凝胶色谱法的原理和方法。1.样品的预处理。样品的预处理。2.色谱柱填料的处理。色谱柱填料的处理。3.色谱柱的装填。色谱柱的装填。在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化发生明显变化的作用叫做的作用叫做，具有缓冲作用的溶液叫，具有缓冲作用的溶液叫做做。基础知识基础知识思考：思考：

4、说出说出说出几种常见的缓冲对说出几种常见的缓冲对NaH2PO4 /Na2HPO4H2CO3/NaHCO3缓冲溶液缓冲溶液由共轭酸碱对组成。这一共轭酸由共轭酸碱对组成。这一共轭酸碱通常称为碱通常称为缓冲对、缓冲剂或缓冲系缓冲对、缓冲剂或缓冲系。常见的。常见的缓冲对主要有三种类型。缓冲对主要有三种类型。H2CO3NaHCO3 ；CH3COOHCH3COONaNH3H2ONH4CL ; NH4OHNH4CLNaHCO3Na2CO3 ；NaH2PO4Na2HPO4 缓冲溶液通常由缓冲溶液通常由种种溶解于水中配制而成。溶解于水中配制而成。 就可以制得在不同就可以制得在不同PHPH范围内范围内使用的缓冲液

5、。使用的缓冲液。 利用利用模拟细胞内模拟细胞内的的PHPH环境，保证环境，保证的的正常结构和功能，便于观察正常结构和功能，便于观察和科学研究。和科学研究。 是一些多糖类构成的是一些多糖类构成的内含许多贯穿的通道的微小多内含许多贯穿的通道的微小多孔的球体。孔的球体。 带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳视频：视频：电泳的原电泳的原理理试验设计试验设计实验材料实验材料动物血液动物血液缓冲溶液缓冲溶液凝胶色谱柱凝胶色谱柱电泳装置电泳装置离心机离心机化学试剂化学试剂实验操作实验操作 离心将血液分层离心将

6、血液分层 用胶头吸管吸用胶头吸管吸出黄色血浆出黄色血浆 用生理盐水洗涤。用生理盐水洗涤。 离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏斗分出红色透明液体。分液漏斗分出红色透明液体。 在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放。在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放。 装入透装入透析袋并置析袋并置于磷酸缓于磷酸缓冲液中冲液中（PH为为7.0）透析。）透析。取胶皮盖取胶皮盖打孔打孔安装玻璃管安装玻璃管安装尼龙网安装尼龙网安装安装100目尼龙纱目尼龙纱组装组装交联葡聚糖凝胶（交联葡聚糖凝胶（G-75）A、固定固定：将色谱柱装置固定在支架上将色谱柱装置固定在支架上B、装填装填

7、：将凝胶悬浮液一次性的将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内装填入色谱柱内C、洗涤平衡洗涤平衡：装填完毕后，用磷酸缓：装填完毕后，用磷酸缓冲液缓冲液充分洗涤平衡冲液缓冲液充分洗涤平衡12小时小时B、待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连收集一试管，连续收集。续收集。1.样品的处理样品的处理血液离心后分层血液离心后分层实验结果与分析实验结果与分析1.洗涤次数过少，未能除去血浆蛋白。洗涤次数过少，未能除去血浆蛋白。 2.离心速度过高和时间过长，白离心速度过高和时间过长，白细胞和淋巴细胞一同沉淀。细胞和淋巴细胞一同沉淀

8、。2.凝胶色谱柱装填凝胶色谱柱装填相关链接相关链接 。 在一定的范围内，能够抵制外加少在一定的范围内，能够抵制外加少量量强酸或强碱强酸或强碱，使原来溶液，使原来溶液PH值值基本保持基本保持不变不变的混合溶液。的混合溶液。根据被分离的根据被分离的蛋白质相对分子蛋白质相对分子质量质量的大小，利用具有网状结的大小，利用具有网状结构的凝胶的构的凝胶的分子筛作用分子筛作用，来进，来进行分离的方法。行分离的方法。带电粒子带电粒子在电场作用下发生迁移在电场作用下发生迁移的过程。的过程。红细胞的洗涤红细胞的洗涤血红蛋白的释放血红蛋白的释放分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液透析透析凝胶色谱柱的制作凝胶色谱柱的制作

9、凝胶色谱柱的装填凝胶色谱柱的装填样品的加入和洗脱样品的加入和洗脱1.2009.山东山东 细胞分化是奢侈基因选择性表达的结果。下列属细胞分化是奢侈基因选择性表达的结果。下列属于奢侈基因的是（于奢侈基因的是（ ）A.血红蛋白基因血红蛋白基因 B.ATP合成酶基因合成酶基因 C.DNA解旋酶基因解旋酶基因 D.核糖体蛋白基因核糖体蛋白基因A解析：解析： 题干中给予题干中给予“细胞分化是奢侈基因选细胞分化是奢侈基因选择性表达的结果择性表达的结果”，根据题干可知，找出，根据题干可知，找出分化的细胞中特殊成分的基因即可，四个分化的细胞中特殊成分的基因即可，四个选项中选项中BCD是所有活细胞中都具体的基是所

10、有活细胞中都具体的基因，而因，而A.血红蛋白基因是分化后的红细胞血红蛋白基因是分化后的红细胞才表达的基因才表达的基因 2.2003全国卷全国卷理综理综 能与人体血液中血红蛋白结合的一种有毒气体能与人体血液中血红蛋白结合的一种有毒气体是是( )A.氯气氯气 B.氮气氮气 C.一氧化碳一氧化碳 D.甲烷甲烷C解析：解析： CO与血红蛋白结合，造成与血红蛋白结合，造成CO中毒，即煤中毒，即煤气中毒。气中毒。填空题填空题1.样品处理中的血红蛋白溶液离心后分层顺序自上而样品处理中的血红蛋白溶液离心后分层顺序自上而下是（下是（ ）-（ ）-（ ）-（ )。有机溶剂有机溶剂脂类物质脂类物质红细胞破碎物沉淀红

11、细胞破碎物沉淀血红蛋白溶液血红蛋白溶液2.一分子血红蛋白最多可携带一分子血红蛋白最多可携带( ) O2分子数和分子数和（）（）CO2分子数。分子数。个个个个选择题选择题1. 随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是（）应用越来越深入，首先要做的一步是（）A. 弄清各种蛋白质的空间结构弄清各种蛋白质的空间结构B. 弄清各种蛋白质的功能弄清各种蛋白质的功能C. 弄清各种蛋白质的合成过程弄清各种蛋白质的合成过程D. 获得高纯度的蛋白质获得高纯度的蛋白质2. 用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白用凝胶色谱法分离蛋白质的过程

12、中，关于蛋白质的叙述，正确的是（质的叙述，正确的是（ ）A. 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质子质量较大的蛋白质B. 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质子质量较大的蛋白质C. 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质子质量较大的蛋白质D. 二者根本无法比较二者根本无法比较A简答题简答题 1.人们用鸡的红细胞提取人们用鸡的红细胞提取DNA，用人，用人(猪、牛、猪、牛、羊）的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？羊）的红细胞提取血

13、红蛋白的原因是什么？ 答：答： 鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。2. 蛋白质的分离和提取的原理是什么？蛋白质的分离和提取的原理是什么？ 答：答： 根据蛋白质各种特性的差异，如根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。亲和力等等，可以用来分离

14、不同蛋白质。 3. 高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？质的何种作用，作用结果是什么被破坏？ 答：答： 两者都利用了蛋白质的变性作两者都利用了蛋白质的变性作用，破坏了其空间结构。用，破坏了其空间结构。1.凝胶色谱法分离蛋白质的原理是怎样的？凝胶色谱法分离蛋白质的原理是怎样的？ 答：凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是答：凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一。根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一。 所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体，所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成

15、，小这些小球体大多数是由多糖类化合物构成，小球体内部有许多贯穿的通道，当一个含有各种球体内部有许多贯穿的通道，当一个含有各种分子的样品溶液缓慢流经时，各分子在色谱柱分子的样品溶液缓慢流经时，各分子在色谱柱内进行两种不同的运动，即垂直向下的运动和内进行两种不同的运动，即垂直向下的运动和无规则的扩散运动。无规则的扩散运动。 相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；路程较短，移动速度较快； 相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入

16、凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。度较慢。 因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，这种现象又对分子质量最小的分子最后流出，这种现象又叫分子筛现象。叫分子筛现象。 此外，凝胶本身具有三维网状结构，相对分此外，凝胶本身具有三维网状结构，相对分子质量大的分子通过这种网状结构，相对分子质子质量大的分子通过这种网状结构，相对分子质量大的分子通过这种网状结构上的空隙时阻力大，量大的分子通过这种网状结构上的空隙时阻力

17、大，而相对分子质量小的分子通过时阻力小，因此不而相对分子质量小的分子通过时阻力小，因此不同分子量的蛋白质分子可以获得分离。同分子量的蛋白质分子可以获得分离。2.什么是缓冲溶液？它的作用是什么？什么是缓冲溶液？它的作用是什么？ 答：答： 在一定范围内，能对抗外来少量强酸、在一定范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液强碱或稍加稀释不引起溶液pHpH发生明显变化的作发生明显变化的作用叫缓冲作用。用叫缓冲作用。缓冲溶液的作用是维持反应体系的缓冲溶液的作用是维持反应体系的pHpH不变。不变。在生物体内进行的各种生物化学过程都是在精在生物体内进行的各种生物化学过程都是在精确的确的pH pH

18、下进行的受到氢离子浓度的严格调控。下进行的受到氢离子浓度的严格调控。 为了在实验室条件下精确的模拟生物体内为了在实验室条件下精确的模拟生物体内的天然环境，就必须保持体外生物化学反应过的天然环境，就必须保持体外生物化学反应过程有与体内过程完全相同的程有与体内过程完全相同的PHPH。 具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。缓冲具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。缓冲溶液通常是由一或两种化合物（缓冲剂）溶解溶液通常是由一或两种化合物（缓冲剂）溶解于水中制得的，调节缓冲剂的配比就可制得不于水中制得的，调节缓冲剂的配比就可制得不同同pHpH范围的缓冲液。范围的缓冲液。3.电泳及其原理是什么？电泳及其原理是什么？

19、答：电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁答：电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。移的过程。 许多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋许多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可解离基团，它们在白质、核苷酸、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的某个特定的pHpH下会带上正电或负电；下会带上正电或负电； 在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动。电泳技术就是在电场带电荷相反的电极方向移动。电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产