川芎中藁本内酯的分离鉴定及药材质量标准研究

1、川芎中藁本内酯的分离鉴定及药材质量标准研究张玲 刘友平 李惠勇 李旻 范婧娴（成都中医药大学 四川成都 610075）摘要：目的：分离藁本内酯对照品对川芎质量标准进行研究。方法：采用硅胶柱层析对川芎中藁本内酯进行分离，UV、1H-NMR、13C-NMR等波谱分析技术鉴定分离成分，并用HPLC法对药材中的藁本内酯进行含量测定。结果：分离成分经鉴定，为Z-藁本内酯；经测定，其药材中含量不低于0.70%。结论：以藁本内酯为对照品建立的含量测定方法将为川芎质量标准提升提供理论依据。关键词：川芎；藁本内酯；成分分离；含量测定Ligustilide Separation and Study onChuan

2、xiong quality standardsZHANG Ling , LIU You-ping , LI Hui-yong , LI Min ,FAN Jing-xian(Chengdu University of TCM, chengdu 610075, China)Abstact:Objective: Ligustilide reference substance separation for Chuanxiong quality standards research. Method:Compound was isolated with silica gel chromatography

3、 and identified by means of spectral analysis ,such as UV、1H-NMR、13C-NMR; HPLC method was established to determine the ligustilide in herbs.Result:Compound was identified to Z-ligustilide and determined no less than 0.70% in herbs.Conclusion: the establishment of the determination of ligustilide wil

4、l provide a theoretical basis of raising Chuangxiong quality standards .Key words: Ligustilide chuanxiong, Ligustilide, Separation of components, Content determination川芎为伞形科（Umbelliferae）植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎，具有活血化瘀、祛风止痛的功效1。现代化学和药理研究表明，藁本内酯具有抗血小板聚集，松驰子宫和气管平滑肌，抑制中枢神经系统等活性2，3 ，在川芎中可达1

5、%以上4，在川芎挥发油中达30 %以上5。因此，藁本内酯可作为川芎药材质量评价的指标成分之一。本研究对川芎药材中藁本内酯进行了分离鉴定，建立了HPLC 测定川芎中藁本内酯的方法，并对川芎主产地药材中的藁本内酯进行了含量测定，提出了川芎中藁本内酯的质量控制指标。1仪器与材料LC-10A高效液相色谱仪（日本岛津公司）；CLASS-VP工作站（日本岛津公司）；SPD-10A紫外检测器（日本岛津公司）；Bruker Avance 600核磁共振仪（瑞士Bruker公司）；紫外可见分光光度计V-VIS 8500(无锡科达公司)；BP211D电子分析天平（十万分之一，德国Sartorius公司）；BUG2

6、5-12超声波清洗机（25kHz，500W，上海必能信超声波有限公司）；R-201型旋转蒸发仪（上海申胜生物技术有限公司）。层析硅胶（100-200目、300-400目，青岛海洋化工厂），甲醇（色谱纯，TEDIA公司），其它试剂均为分析纯（成都市科龙化工试剂厂）。川芎药材于2007年11月自购于都江堰徐渡乡川芎GAP基地，经成都中医药大学中药鉴定教研室陈新副教授鉴定为Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎。2方法及结果2.1 藁本内酯的分离鉴定 2.1.1 制备工艺：川芎粗粉1.5kg，乙醇渗漉，提取物上硅胶柱层析，以石油醚（6090）-乙酸乙酯混合溶剂梯度洗脱，TL

7、C检查合并相同组分，再进行石油醚（3060）-乙醚洗脱，得纯品。2.1.2 结构鉴定：该化合物为淡黄色油状物，略有酯香味；UV max(nm)：208，280，320；1H-NMR、13C-NMR数据与文献6数据对照，鉴定为Z-藁本内酯。波谱数据及其归属见表1，结构式见图1。Table 1 1H-NMR、13C-NMR（CDCl3）data and attribution of CompoudLocation1H ppm1H ShapH No.13C ppm1167.543148.513a147.1942.61dd228.0952.48m222.3666.02m1130.0276.28d111

8、6.877a123.8085.23t1112.9392.38q222.34101.50m218.44110.96t313.73Fig.1 Z- Ligustilide2.2 藁本内酯稳定性研究 文献7,8报道，藁本内酯在室温条件下极不稳定，保存15d纯度由99.48% 降至41.97%，4冰箱中5d后含量就降到86.67 %；藁本内酯在氯仿中可稳定保存1年。实验研究表明，藁本内酯对照品在- 18冰箱中90d内含量几乎没有变化，可见避光低温有利于保存。2.3 川芎药材中藁本内酯的HPLC含量测定2.3.1 色谱条件：色谱柱：HypersiL ODS C18（4.6mm200mm，5m）；流动相：

9、甲醇水（60：40）；流速1.0ml/min；检测波长320nm。在此色谱条件下，川芎药材中藁本内酯与其它组分能达到基线分离（见图2）。Fig.2 HPLC-Chromatogram of reference substance and sample A. reference substance；B. sample；a. Z- Ligustilide2.3.2 对照品溶液的制备：取藁本内酯对照品约60mg，精密称定，置25ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为2.42mg/ml的对照品储备液，精密量取1ml，置10ml容量瓶，加甲醇稀释置刻度，摇匀，即得。2.3.3 供试品溶液的

10、制备：取药材粉末(过3号筛) 0.5g，精密称定，置50 ml 具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密闭，称重，超声提取45min后取出，称重，加甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。2.3.4线性范围考察：分别精密吸取0.2ml、0.5ml、1ml、1.5ml、2ml的藁本内酯对照品储备液，置10ml容量瓶中，加甲醇稀释置刻度，摇匀，得浓度分别为0.0484mg/ml、0.121 mg/ml、0.242 mg/ml、0.363 mg/ml、0.484 mg/ml的对照品溶液，吸取上述不同浓度的对照品溶液各10l，分别进样测定，以藁本内酯质量x（g）对峰面积积分值A进行线性回归，得标准曲

11、线方程A=2167715x+116629，r=0.9998，表明藁本内酯在0.484g4.84g范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。2.3.5 精密度试验：取对照品溶液，依选定的色谱条件连续进样6 次，测定峰面积，其RSD为0.58 %( n = 6) 。2.3.6 稳定性试验：分别取对照品溶液和供试品溶液于棕色瓶中，密闭、室温保存。于0，2，6，12，24 h 进样2次，测定藁本内酯的峰面积，其RSD分别为0.38 %，0.86 % ( n = 5)。说明藁本内酯在此溶液中稳定性良好。2.3.7 重复性试验：取同一样品粉末6份，照供试品溶液制备方法制成供试品溶液，进样测定，计算藁本内酯的含

12、量，其RSD为1.89 % ( n = 6)。说明此方法重复性良好。2.3.8 加样回收率试验：取已知藁本内酯含量的川芎药材约0.25 g，6份，精密称定。分别精密加入藁本内酯量的对照品溶液5ml和10ml甲醇。按照供试品溶液制备方法制成供试品溶液，分别测定藁本内酯的含量。其平均回收率为96.27 % (RSD 2.8 %，n = 6)。Tab2 Average recovery of LigustilideSamplesContent/mgAdded/mgFound/mgRecovery /%Average recovery/%RSD/%11.8751.213.01897.8221.8621

13、.212.98796.8831.8841.213.00597.0998.6252.1341.7991.213.086102.5651.8581.213.01198.1461.9211.213.10899.262.3.9 样品测定：取川芎样品10份，按供试品溶液的制备方法制成供试品溶液，各进样10l测定2次。根据回归方程计算样品中藁本内酯的含量。结果表明药材中藁本内酯含量不低于0.70%。3讨论3.1 传统方法提取川芎挥发油多采用水蒸气蒸馏提取，提取温度高，且蒸馏液为油水混合物，不易分离，得率低；本实验采用乙醇渗漉提取川芎油，条件温和，经济高效，能使川芎中挥发油类成分不被破坏，得到较好的分离。3

14、.2 川芎药材现有标准（中国药典2005年版）尚无含量测定，本实验对川芎中有效成分藁本内酯进行了分离鉴定，并以此为对照品，建立了HPLC含量测定方法，所做工作将为川芎药材标准的提升提供理论依据。参考文献：1ZHANG T M.The Chinese Herbal pharmacy.ChangSha:Hunan Science and Technology Publishing House，2002，255-256.2 SATCM of Chinese herbal medicine Editorial Board. The Chinese herbal medicine.Vol.5.Shang

15、hai:Shanghai Science and Technology Publishing House,1999:976,893.3TAO J Y. Angelica component ligustilides effect of antiasthmatic.Pharmaceutical Journal，1984，19(8):561.4WU G T，SHI L F，HU J H. Research of determinating ligustilide in Chuanxiong by Supercritical fluid extraction .Pharmaceutical Jour

16、nal，1998，33(6)：457.5LING Y Z，TANG X，BI K S.Determinating ligustilide in Chuanxiong volatile oil with RP-HPLC. Chinese Journal of Traditional Chinese Medicine，2004，29(2)：154.6JING D P，PEN G P，LU X F.The preparation of Chuanxiong ligustilide reference substance. Chinese Herbal Medicine，2006，1（37）：65.7LI G S，MA C J，LI X Y.The s