石油化工过程系统概论 第九章

1、 的相对荧光比例,反映了HK -2细胞线粒体C L 的氧化损伤加强,其结果将导致与其紧密结合的细胞色素c 释放入胞浆,从而启动线粒体介导的、半胱天冬蛋白酶(Caspase级联的凋亡途径12。综上所述,铅可能是通过加强HK -2细胞ROS 产生,增强氧化应激水平,损伤细胞线粒体,从而启动线粒体途径的细胞凋亡。通过诱发肾细胞过度凋亡可能是铅致肾细胞毒性作用的机制之一。参考文献:1 Huang W J,Tung C W,Ho C,et al.Ras activation modulatesmethylglyoxa-l i nducedmesangialcellapoptosisthroughsupe

2、rox ide production.Ren Fail,2007,29:911-921.2 Kaewsuya P,Danielson N D,Ekh terae D.Fluorescentdetermination of cardiolipin usi ng 10-N -nonyl acridine orange.Anal Bioanal Chem,2007,387:2775-2782.3 魏肖莹.铅中毒肾组织病理学观察.广东微量元素科学,1998,5:51-53.4 朱彩菊,张霞,倪蕴娥,等.长期接触铅作业工人肾功能损害探讨.劳动医学,1999,16:226-228.5 Jurisic V.

3、Esti mation of cell membrane alteration after drugtreatment by 乳酸脱氢酶release.Blood,2003,101:2894-2895.6 Ryan M J,Johnson G,Kirk J,et al.HK -2:an i mmortalizedproxi mal tubule epithelial cell line from normal adult human kidney.Kidney Int,1994,45:48-57.7 杨杏芬,庄志雄,魏青,等.铅对肾上腺皮质细胞线粒体的氧化损伤.中山医科大学学报,2001,22

4、:14-18.8 Chen L,Yang X,Jiao H,et al.Tea catechins protect againstlead -induced ros formation,mi tochondrial dysfunction,andcalcium dysregulation in PC12cells.Chem Res Toxicol,2003,16:1155-1161.9 Tampo Y,Kotamraju S,Chi tambar C R,et al.Oxidativestress -induced iron signaling is responsible for perox

5、 ide -dependent oxidation of dichlorodihydrofluorescein in endothelial cells:role of transferrin receptor -dependent iron up take in apoptosis.Circ Res,2003,92:56-63.10 Desagher S,Martinou J C.M i tochondria as the central controlpoint of apoptosis.Trends Cell Bi ol,2000,10:369-377.11 Chicco A J,Spa

6、ragna G C.Role of cardiolipin alterations inmitochondrial dysfuncti on and disease.Am J Physiol Cell Physiol,2007,292:33-44.12 Lu M C,Tzang B S,Kuo W W,et al.More Activated CardiacMitochondria -l dependent Apoptotic Path way in Obese Zucker Rats.Obesity (Silver Sp r i ng ,2007,15:2634-2642.(收稿日期:200

7、8-03-24中图分类号:X513 文献标识码:A 文章编号:1002-3127(200805-0362-03#实验研究#体外应用抑制性消减杂交技术克隆和筛选大气细颗粒物(PM215污染相关基因朱丽瑾,肖芸,钱亚玲,钟惠仙(浙江省医学科学院卫生学研究所,浙江杭州310013关键词:大气污染;细颗粒物;基因表达基金项目:浙江省医药卫生优秀青年科技人才专项科研基金(2004Q N002作者简介:朱丽瑾,助理研究员,研究方向:分子毒理学。大气细颗粒物(Fine Particular Matter,P M215是指空气动力学直径小于215L m 的分散在大气中的固态或液态颗粒物物质。国外大量流行病学研

8、究资料提示,颗粒物浓度的上升与疾病的发病率、死亡率关系密切,尤其是呼吸系统疾病及心血管疾病1-2。我国是细颗粒物污染严重的国家,但对细颗粒物的研究目前仍处于起步阶段。因此,本实验选用抑制性消减杂交(Suppressing Subtractive Hybridization,SSH技术克隆经春季01065mg P m 3PM215与夏季01065mg P m 3P M215染毒的人胚肺细胞间的基因差异表达并对之进行分析,其结果期望寻找出与大气污染致病相关的重要基因,从而为大气污染致病生物学机制的阐明提供基因表达方面的依据。1材料与方法111材料颗粒物采样器(PM10PM215-2型,地质矿产部北

9、京地质仪器厂,人胚肺WI-38细胞株(中科院上海细胞所。消减杂交试剂盒(美国B D公司,热启动聚合酶链式反应法(PC R试剂盒(德国Qiagen公司, PC R-Select Diffenrential Screening Kit(美国BD公司,地高辛标记与检测试剂盒(德国Roche公司。112PM215的采集采用直径80m m的玻璃纤维滤纸,在杭州市中心繁华地段采集春夏两季的PM215颗粒物,采样流量78L P min,每次采样时间24h。采样点位于距路面3m左右的平台,距公路约5m。春季采样时间为45月,夏季采样时间为78月,分别采样30 d。PM215采集方法按说明书进行。113细胞模型

10、构建选择WI-38人胚肺细胞株,用含体积分数为10%的胎牛血清的DME M培养液在37e、体积分数为5%的CO2和饱和湿度的环境中培养,并以终浓度为100L g P ml的春季01065mg P m3样品与夏季01065mg P m3(美国EPA1997年PM215质量标准样品分别处理,每周处理1次,每次24h,共染毒8周。以杭州春季01065mg P m3PM215处理的WI-38细胞为检测样本(Tester,以夏季01065mg P m3样本处理的WI-38细胞为驱赶样本(Driver。114mRNA提取按照mRNA提取试剂盒说明书进行,最后溶于20L l缓冲液中,经测定吸光度值260P

11、280、mRNA含量与甲醛变性凝胶电流验证其纯度与完整性。115SSH操作按说明书进行。以两种染毒细胞的mRNA各2L g为模板合成双链cDNA;2种cDNA均用Rsa酶切,酶切后的Tester-cDNA分成2份,分别与接头Adaptor1和Adaptor2R连接,Driver-cDNA不与Adaptor连接;分别将加了接头的2份Tester-cDNA与Driver-c DNA混合,68e温育8h,进行第1轮杂交;上述2个反应产物混合后再次加入足量的Driver-cDNA, 68e温育过夜,进行第2轮杂交;杂交产物进行2轮(PCR扩增。116cDNA消减文库的构建将PCR产物纯化后,连接到载体

12、pDriver Cloning Vector,转化感受态细胞QIAGE N EZ C ompetent Cells,蓝白斑筛选,挑取阳性克隆于溶菌肉汤培养液中,37e水平震荡过夜培养,取1 ml培养菌液送Takara公司测序,剩余菌液用于斑点杂交法鉴定。1 17斑点杂交鉴定取1L l阳性菌液点于尼龙膜上,分别以等量地高辛标记的Tester-cDNA和Driver-cDNA 为探针进行斑点杂交,操作按BD公司PCR-Select Differential Screening Kit说明书进行。118同源性分析将获得的cDNA测序结果与美国国家生物技术信息中心(NCBI的nr数据库和dbEST 数

13、据库进行同源性比较及序列间两两比较,将新cDNA 序列向GenBank申请注册。2结果211SSH结果用SSH技术,分离2种PM215处理的WI-38细胞间差异表达(01065mg P m3样品高表达的基因片段,第2轮PCR结果可见220与350左右2条条带。将PCR产物克隆转化感受态细胞。将获得的克隆随机挑取8个进行测序,重组体中载体测定结果与载体试剂盒手册中提供的序列完全一致,说明测序结果可靠。将测序结果与Genbank的已知基因序列进行比对,这8个克隆代表了1个已知基因序列和1个未知基因序列。其中1个已知序列为白介素2(IL-2基因片断,未知基因序列提交给Genbank的dbEST数据库

14、,已被Genbank接受,登录号为ES880897L。212斑点杂交鉴定显色可见与tester cDNA杂交的24个点中,有22个显紫色,选取的8个进行测序的克隆均在这22个显色的点中。而与driver cDNA杂交的点均未见明显显色(图1。13:与tester cD NA杂交;46:与driver cD NA杂交图1差异片段的斑点杂交3讨论研究表明,10L m以下的颗粒物可进入鼻腔,7L m 以下的颗粒物可进入咽喉,小于215L m的颗粒物则可深达肺泡并沉积,进而进入血液循环3。欧洲大气静化(The Clean Air for Europe,C AFE计划指出细颗粒物造成欧洲每年30万人早死

15、,降低平均寿命816个月4。PM215的实验研究表明颗粒物吸附许多复杂组分如:有机多环芳烃类及重金属镍、镉、铬等。它们可直接或间接作用于DNA,引起DNA损伤、断裂或DNA 加合物形成,也可通过与细胞作用产生活性自由基间接作用于DNA,诱导DNA链断裂5。基于对颗粒物健康危害的认识,颗粒物目前已受到了全世界的普遍关注。美国环境保护局(EPA已经于1997年颁布了细颗粒物空气质量标准,并于2006年重新修改,其限制非常严格6。我国人群死亡率前10名中,因呼吸系统疾病而死亡者居城市总死亡率的第3位,而肺癌是常见的癌症死亡原因,并呈现逐年上升趋势。研究表明,空气污染与癌症、心血管疾病的发病率增加及总

16、死亡率增加有关。我国颗粒物污染相当严重,中国五大城市调查显示TSP几乎全年超过我国空气质量二级标准。1996年我国颁布了PM10空气质量标准,并逐步用PM10监测代替了TSP。而研究表明,PM215更能体现颗粒物污染与人体的健康关系。张文丽等7对我国北京、太原两城市PM215污染进行的调查发现细颗粒物污染相当严重,超标倍数达110810147倍。笔者亦对杭州市PM215污染状况进行调查,污染程度轻于北京、太原状况,但与2006年美国新颁布的质量标准相比污染仍较严重。随着工业化、城市化的发展,如果不对其进行监测、控制,PM215的污染将越来越严重,如果长期吸入细颗粒物污染的空气,必将严重危害人类

17、健康。本研究利用体外细胞培养,选用SSH技术克隆出 01065mg P m3与01065mg P m3PM215对人胚肺细胞的差异表达基因序列。研究结果共克隆到两条基因序列,其中一条为未知序列,另一条与IL-2同源。I L-2对多种细胞有促进增殖和分化作用,正常机体,主要由淋巴细胞和巨噬细胞产生。近年有研究显示,肿瘤细胞亦可表达IL-2。污染细颗粒物IL-2的上调可能与其对人体健康损害密切相关。本研究只得到两个基因序列,原因是driver选择了低于标准的PM215颗粒,而非空白对照。SSH技术灵敏度较高,用空白对照可能会克隆出数百上千个克隆,在选择时只能随机选择进行阳性克隆进行分析。因此本研究采用了01065mg P m3与01065mg P m3的样品进行了分析。今后尚需对I L-2与P M215的污染的关系作进一步研究,对未知基因序列的功能进行分析和鉴定,以确定其与PM215的关系,进一步阐明PM215生物学效应机制。参考文献:1IEC.Industrial Economics:Expanded Expert JudgmentAssessment of the Concentration-Response RelationshipBetween PM215Exposure and Morta