钟一声 慢性高眼压大鼠视神经中小胶质细胞巨噬细胞的激活研究

1、钟一声 慢性高眼压大鼠视神经中小胶质细胞/巨噬细胞的激活研究    【摘要】  目的 探讨慢性高眼压大鼠视神经中小胶质细胞/巨噬细胞的激活分布情况。方法 结扎两条巩膜上静脉建立慢性高眼压大鼠模型，应用OX-42单克隆抗体行免疫组化检测视神经中小胶质细胞/巨噬细胞的激活分布情况。结果 对照眼视神经中小胶质细胞/巨噬细胞呈圆状、柱状，无明显树突样突起；慢性高眼压眼视神经中小胶质细胞/巨噬细胞呈阿米巴状、柱状，有树突样突起，细胞数量增加，术后第1周，视神经中小胶质细胞/巨噬细胞数量为49.61±8.04/3个400倍视野。此后视神经中小胶质

2、细胞/巨噬细胞数量逐渐减少。术后第1周至第8周视神经中小胶质细胞/巨噬细胞的数量与同期对照眼相比差异有显著性（P<0.05）。术后第12周，视神经中小胶质细胞/巨噬细胞的数量与同期对照眼相比差异无显著性（P>0.05）。结论 慢性高眼压可致视神经中小胶质细胞/巨噬细胞激活，细胞数量增加，但随时间延长逐渐降低。 【关键词】  慢性高眼压大鼠 视神经 小胶质细胞 巨噬细胞 OX-42 激活    新近研究表明，免疫因素参与了青光眼视神经病变的病理生理过程1。神经胶质细胞，主要是小胶质细胞，一直以来被认为有传递抗原的作用，并与中枢神经系统免疫病理的

3、发生、发展有关。作为中枢神经系统的组织巨噬细胞，小胶质细胞在多种自身免疫性神经退行性疾病（如阿茨海默氏病）的病理过程中有关键的调节和影响作用2。青光眼视神经中的小胶质细胞亦很有可能参与了青光眼的免疫病理过程1。小胶质细胞在青光眼视神经损害过程中的激活和分布及其作用目前尚未完全明了。本实验主要探讨慢性高眼压大鼠视神经中小胶质细胞/巨噬细胞的激活分布情况，为进一步研究其在青光眼视神经损害中的作用提供实验基础。    1  材料与方法    1.1  实验动物  雄性健康纯种Sprague-Dawley（SD）

4、成年大鼠28只，体重200250 g，由上海宝牧实验动物养殖场提供，生产许可证号码：SCXK（沪）2004-0007，使用许可证号码：SYXK（沪） 2003-0026。裂隙灯检查屈光间质清晰，直接眼底镜检查眼底正常。饲养环境：光照早晨6点至晚上6点，室温1825。左眼为实验眼，右眼作为对照。    1.2  巩膜上静脉结扎建立慢性高眼压模型  按30 mg/kg自腹腔注入3%的戊巴比妥钠对大鼠进行麻醉后，用0.5%爱尔卡因滴眼液表面麻醉1次。行常规眼部消毒，上、下眼睑缝线开睑，于该眼的1：00方位的角巩膜缘处，平行于角巩膜缘方向剪开球结膜和其

5、下方的Tenon囊，每条切口长约3 mm。沿切口的两端行结膜和Tenon囊放射状切开，并向后分离直到找到该处的巩膜上静脉，用10-0尼龙线将其结扎，结扎成功的标志是血管远端血流中断。同样方法结扎4：00方位的巩膜上静脉。术后结膜囊内涂红霉素眼膏封眼。对侧眼做同样切口及分离球结膜但不予结扎巩膜上静脉，作为对照眼。    1.3  眼压（intraocular pressure，IOP）测量  术前和术后每周2次用Goldmann压平眼压计（鼠用型）进行双眼IOP测量，所有眼压测量均为同一操作者完成，测量在暗室内进行，时间在18：0020：00。I

6、OP测量前，用3%戊巴比妥钠对大鼠进行腹腔麻醉（25 mg/kg），由专人将大鼠固定于自制大鼠固定器上，置于裂隙灯架前进行IOP测量并记录。连续测量3次，取平均值，每次测量间隔时间为3 min，3次IOP测量值之间相差不超过3 mmHg。    1.4   动物处理和取材  将成模的15只慢性高眼压鼠分别分成术后1、2、4、8、12周组，每组3只。按组别完成眼压、眼前段观察及眼底照片后，予过量戊巴比妥钠对大鼠进行腹腔注射处死大鼠，摘取双眼眼球并尽可能包含较长的眶内段视神经，并置于10%福尔马林溶液中固定48 h以上。眼球固定后，在解剖

7、显微镜下紧贴巩膜表面剪下视神经。按常规石蜡切片方法将视神经梯度脱水、透明、定向包埋和切片（厚5 ?滋m）。    1.5  免疫组化染色  切片常规脱蜡复水，3H2O2室温处理10 min；用TBS缓冲液（0.05M，pH7.6）清洗切片3次，每次2 min；柠檬酸溶液（0.01M， pH6.0）1500 ml高压沸煮90 s修复抗原；TBS缓冲液清洗切片3次，每次5 min。加入OX-42小鼠抗大鼠单克隆抗体（1：100，英国Abcam公司）于4°C冰箱过夜。用TBS缓冲液清洗切片3次，每次    5

8、min。加入抗（羊抗小鼠IgG，美国KPL公司）室温处理30 min；TBS缓冲液清洗切片3次，每次   5 min；滴加新鲜配制的DAB溶液（武汉博士德生物工程有限公司），在显微镜下观察掌握染色程度，待出现阳性染色颗粒时，立即放入清水漂洗终止显色。苏木素复染，脱水，透明，封片。    1.6  阅片及图像分析  阅片采用Axioskop 2 Plus 生物显微镜，放大倍数为400×，观察OX-42阳性细胞的形态及分布情况。用Image-Pro Plus图像分析软件进行分析，分别对术后1、2、4、8、12周组的双眼

9、视神经OX-42表达阳性的细胞密度进行分析。每张切片随机取视神经周边区、旁中心区和中心区3个视野，计数3个视野中OX-42阳性细胞的的数量。    1.7  统计学方法  本实验的所有数据均以数据库文件形式贮存于磁盘上，采用SPSS for Windows，Ver 13.0.4软件在计算机上进行统计处理，统计方法为配对t检验。    2  结果    2.1  眼压  28只SD大鼠中有15只实验眼IOP较对侧眼有不同程度的升高。随着术后观察时间的延长，实

10、验眼的IOP逐渐下降，至术后第8周，实验眼IOP维持在24 mmHg以上，与同期对照眼相比，差异具有显著性（P<0.001）；但术后第8周以后，实验眼IOP已降至20 mmHg左右，与对侧眼IOP间差异已无显著性（P>0.05）。    2.2  视神经小胶质细胞/巨噬细胞的激活情况  对照眼视神经可见少许小胶质细胞/巨噬细胞着染，分布稀疏，细胞形态呈圆状、柱状，无明显树枝状突起（见图1A）。术后第1周和第2周，实验眼视神经小胶质细胞/巨噬细胞数量明显增加，细胞体积增大，细胞多呈阿米巴状和柱状，有树枝状突起（见图1B，1C）；术后第

11、4周和第8周，实验眼视神经小胶质细胞/巨噬细胞数量较第1周和第2周逐渐减少，细胞仍呈阿米巴状和柱状，可见树枝状突起（见图1D，图1E）；术后第12周，实验眼视神经小胶质细胞/巨噬细胞分布稀疏，细胞呈柱状和圆形，突起少（见图1F）。    2.3  视神经小胶质细胞/巨噬细胞细胞计数  术后第1周至第12周视神经OX-42阳性染色细胞数见表1。从表中可以看出，术后第1周，实验眼视神经OX-42阳性染色细胞数明显增加，与对照眼相比差异有显著性（P<0.05）。术后第2周至第8周，随着实验时间的延长，视神经OX-42阳性染色细胞数逐渐减少，但与

12、同期对照眼相比差异仍有显著性（P<0.05）。术后第12周，实验眼神经OX-42阳性染色细胞数与对照眼相比差异无显著性（P>0.05）。    3  讨论    3.1  大鼠小胶质细胞的表达标记物  小胶质细胞最显著的特点之一是对外界环境刺激非常敏感。在微环境发生变化时，小胶质细胞可迅速作出反应，开始大量表达一些与抗原识别和提呈有关的特异性膜表面分子，如主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex，MHC）和补体受体CR33。补体受体CR3是由、两条

13、肽链以非共价键结合而构成的异二聚体糖蛋白，分子量分别为165kDa和95kDa，CR3的链为CD11b，链为CD183。大鼠和小鼠的视神经小胶质细胞表达OX-41，OX-42，OX-3，OX-6，OX-18，EDI，MACI，F4/80等4。OX-42为CD11b单克隆抗体，当小胶质细胞激活并大量表达CR3时，OX-42能够与CR3的链（CD11b）发生抗原抗体反应。Lam等5单纯应用OX-42单克隆抗体来标记大鼠视神经和视网膜中的小胶质细胞，但巨噬细胞亦有OX-42的表达6，因此OX-42单克隆抗体标记的细胞应包含有小胶质细胞和巨噬细胞，故本研究所检测到的细胞应为小胶质细胞/巨噬细胞。

14、60;   3.2  小胶质细胞在视网膜免疫反应中的作用  由于血脑屏障将中枢神经组织和免疫系统分开，正常情况下免疫系统的细胞和分子不能进入脑组织。视神经作为中枢神经系统的一部分，在正常情况下也属于免疫赦免区。近来研究发现，在某些视网膜和视神经疾病的病理过程中，血视网膜屏障受到损伤，外周免疫细胞可以进入视网膜，而小胶质细胞在视网膜的免疫反应中起着重要作用。?譹?訛递呈抗原作用：小胶质细胞是目前已知的视网膜抗原递呈细胞，其具有外周巨噬细胞相同的表面标记及效应分子，如MHC-I、MHC-II、CR3受体和Fc受体，并表达低水平的CD4抗原和B细胞共同抗原等。

15、在特异性免疫应答中，绝大多数抗原都经过小胶质细胞/巨噬细胞摄取、加工、处理、递呈抗原并激发特异性免疫应答。小胶质细胞摄取抗原后在细胞内加工，精选出免疫原性多肽，后者与胞内MHC-II类分子结合成复合物，并被递呈给辅助性T细胞，进行免疫应答7。?譺?訛免疫调节作用：小胶质细胞通过递呈抗原和分泌各种细胞因子而激活或增强免疫应答，起到免疫调节的作用。在正常视网膜和视神经中，小胶质细胞一般处于静止状态，但易被微小的病理变化所激活，激活状态的小胶质细胞可表达大量与炎症及吞噬作用密切相关的受体和因子，如分泌生长因子等，并吞噬损伤的神经元、胶质细胞碎片以及外来抗原，对机体产生有益的保护效应。而小胶质细胞在特

16、定的条件下也可通过免疫增强导致神经系统的病理损伤8，如可以产生大量的超氧阴离子、一氧化氮、花生四烯酸衍生物、兴奋性氨基酸以及其他一些潜在的神经毒素，如肿瘤坏死因子-（tumor necrosis factor，TNF-）、白介素-1、干扰素-，导致神经元死亡。    3.3  慢性高眼压下小胶质细胞/巨噬细胞的激活   最近一些研究结果提示小胶质细胞参与了青光眼视神经病变的过程。Neufeld9研究发现，在青光眼患者视乳头中，该细胞发生活化，细胞形态与分布均发生了变化。他们还发现，青光眼视神经星形胶质细胞和小胶质细胞中TNF-等毒性因

17、子的表达明显增高，而TNF-具有介导细胞凋亡的作用。Yuan等10发现在青光眼动物模型中，仅在眼压升高2 h，小胶质细胞标志物OX-42的表达就已经明显增加，并且早于视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）的死亡。Naskar等11也观察到，在大鼠青光眼活体眼中，小胶质细胞吞噬了被荧光标志的RGCs，并在未死亡的RGCs周围亦有小胶质细胞的聚集。    本实验发现，大鼠慢性高眼压后第1周即可见实验眼视神经中小胶质细胞/巨噬细胞数量明显多于同期对照眼，并且细胞形态发生了改变，细胞体积增大，多呈阿米巴形、条形。随着实验时间的延长，第2

18、周至第8周实验眼视神经中小胶质细胞/巨噬细胞数量逐渐减少，但与同期对照眼相比，差异仍有显著性。术后第12周实验眼视神经中小胶质细胞/巨噬细胞的数量与同期对照眼相比差异已无显著性。我们前期的实验发现，通过本方法制作的高眼压模型在术后第8周时其视神经凹陷才逐渐开始扩大（另文待发表）。通过与前期的实验结果相匹配，发现小胶质细胞/巨噬细胞的激活早于视神经的损伤，这与Yuan和Naskar等的结果基本一致10-11。    关于小胶质细胞的变化与青光眼视神经病变的因果关系目前尚不能确立。近年来，通过对阿茨海默氏病、多发性硬化和帕金森氏病等研究发现2，这些患者青光眼的发生率明显高于正常人数倍，而它们在疾病性质方面同属于神经退行性疾病。对上述这些神经系统疾病的发病机制的研究已经证实活化的小胶质细胞通过释放多种因子和自由基介导了这些神经退行性疾病。小胶质细胞是否也介导了青光眼视神经损害，是非常值得研究的课题。【参考文献】  1 Tezel G， Wax MB. The immune system and glaucomaJ. Curr Opin Ophthalmol，200