不同年龄大鼠颗粒性脑蛋白聚糖的比较研究

1、第24卷第2期2003年4月西安交通大学学报（医学版）Journal of Xi an Jiaoton g Universit y （Medical Sciences ）Vol. 24No. 2A p r. 2003不同年龄大鼠颗粒性脑蛋白聚糖的比较研究梁雪清，田梦玉（西安交通大学医学院生化教研室，陕西西安摘要：目的探讨颗粒性脑蛋白聚糖（PG ）与脑发育和老化的关系。方法710061）纯种SD 大鼠随机分为3组：初生组、颗粒性脑青年组和近老年组。脑组织经脱脂处理后，L -1盐酸胍提取各组大鼠颗粒性脑PG ，4mol DEAE-Se p hacel 柱层析分离纯化，双向电泳法分析其糖胺多糖（GA

2、G ）的组成。结果Se p harose 4B 柱层析分析其分子大小，素蛋白聚糖（DSPG ）的比例随增龄而增高，而小分子CSPG 的比例则随增龄而降低。结论年龄的增长发生一定的变化，与脑的发育和老化密切相关。关键词：脑蛋白聚糖；糖胺多糖；发育中图分类号：R 654. 2文献标识码：A文章编号：（2003）1671-825902-0101-04大分子硫酸软骨素蛋白聚糖（CSPG ）主要存在于初生组和青年组；小分子硫酸皮肤PG 的提取率随增龄而降低；颗粒性脑PG 随动物Com p arative stud y on p articulate brain p roteo g l y cans in

3、 rats of different a g esLian g Xue q in g ，Tian Men gy u（De p artment of Biochemistr y ，Medical School of Xi an Jiaoton g Universit y ，Xi an 710061，China ）ABSTRACT ：Ob j ective（PG ）with develo p ment To stud y the association of p articulate brain p roteo g l y canSD rats were divided into three g

4、rou p s ：new born ，y oun g adult and near oldL -1g rou p s. After brain tissues were defatted ，p articulate brain PGs of each g rou p were extracted with 4mol of g uanidine HCl and p urified b y DEAE-se p hacel chromato g ra p h y ，their molecular sizes were identified b y（GAG ）com p ositions were c

5、haracterized b y two Se p harose 4B chromato g ra p h y and their g l y cosamino g l y canThe extraction rates of p articulate brain PGs decreased with a g e ；thelar g e molecular-size p articulate CSPG mainl y existed in new born and y oun g adult g rou p s ；the p ercenta g e of small molecular-siz

6、e DSPG increased and CSPG declined with a g e. ConcIusion with a g e and are related to brain develo p ment and a g in g .Particulate brain PGs chan g edimensional electro p horesis. ResuItsand a g in g of the brain. MethodsKEY WORDS ：brain p roteo g l y can ；g l y cosamino g l y can ；develo p ment

7、脑组织中的蛋白聚糖（p roteo g l y can ，PG ）主要有硫酸软骨素蛋白聚糖（CSPG ）、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG ）和硫酸皮肤素蛋白聚糖（DSPG ）等1，2类，其特点是易提取的可溶性脑PG 占的比例较大，而难提取分离的颗粒性脑PG 占的比例较小。近年来国外学者开始研究脑PG 与发育和老3化的关系，但研究对象多为可溶性脑PG ，且多选择某一部位进行研究，难以反映全貌，也难以深入阐明颗粒性脑PG 与脑的发育和老化的关系。本研究在改进提取分离方法的基础上，对大鼠颗粒性脑PG 进行提取和分离，同时对不同年龄组（初生组、青年组及近老年组）颗粒性脑PG 的分子特收稿日期：修回日期

8、：2002-08-082002-10-21基金项目：国家自然科学基金资助（No. 39070240）通讯作者：田梦玉. Tel ：（029）5275816作者简介：梁雪清（1970-），女（汉族），博士/讲师. 研究方向：基因诊断和治疗. 现在广州医学院生化教研室（510182）Tel mail ：LXQ76hotmail. com点进行了比较分析，旨在对颗粒性脑PG 与发育年龄的关系有一个全面的了解，为今后进一步研究颗粒性脑PG 的分子与功能的关系提供线索。11. 1材料和方法酶和试剂链酶蛋白酶（E ，；盐Merck 产品）酸胍（上海试剂总厂产品经活性碳处理后再结

9、晶）；DEAE-Se p hacel 、Se p harose 4B （Pharmacia 产品）、硫酸乙酰肝素（HS ）、硫酸皮肤素硫酸软骨素（CS ）（DS ）及透明质酸（HA ）标准物为芝加哥大学Hor-witz 博士惠赠。1. 2动物处理将SD 纯种大鼠按年龄分为3组：（生后1d ）；（34个月龄）；初生组青年组（15个月龄以上）。各组动物均于实验近老年组前准确称取体重，立即断头处死，剥离全脑，用冰冷的Tris-HCl （10mmol L -1，反复冲洗，除去p H 7. 2）卷附着在脑表面的血液，滤纸除去多余的缓冲液，分别准确称重后进行匀浆和提取实验。3大鼠脑经准确称重后，用1. 3

10、脑PG 的提取（p H 20倍体积的10mmol L -1Tris-HCl 缓冲液在冰浴下充分匀浆，其间4提取48h 以上，7. 2）表1分组初生组青年组近老年组大鼠颗粒性脑PG 的提取量n 801517（x ±s ）-351312己糖醛酸/g -1脑湿重提取率/%g180. 35±19. 00*39. 60±2. 2444. 41±1. 98不断振荡。经离心后分为上清部分（内含可溶性脑和沉淀颗粒部分（内含细胞结合性脑PG ）。将PG ）沉淀颗粒部分经丙酮及氯仿（V ）（V ）：/甲醇2:1脱脂处理后，加入4mol L -1盐酸胍2mL ，4提注：与其他

11、两组相比*P <0. 052. 2DEAE-Se p hacel 柱层析为了进一步得到纯化的颗粒性脑PG ，将上述各提取物分别上DEAE-并用含0. 11mol L -1NaCl 的Se p hacel 层析柱，取48h 以上，其间不断振荡，进一步提取分离颗粒性脑PG 。在上述提取液中加入4倍体积的乙酸钠饱和乙醇沉淀PG ，4放置过夜，离心，弃上清。再依次加入少量的无水乙醇和乙醚脱水干燥，得PG 的初提样品。1. 4脑组织PG 的分离纯化DEAE-Se p hacel柱层析5：将PG 样品用58mL 7mol L -1尿素0. 1mol L -1NaCl ，50mmol L -1NaAC

12、 ）溶解，上DEAE-Se p hacel 柱（1×10cm ），用7mol L -1尿素（内含0. 11mol L -1NaCl ，50mmol L -1NaAC ，p H6. 7）进行梯度洗脱，计时收集，流速为3mLh -1，每管收集1mL 。Se p harose 4B 柱层析6：将DEAE-Se p hacel 柱层析后所得的各峰值管样品溶于1mL 1mol L -1盐酸胍（内含50mmol L -1Tris-HCl ，2mmol L -1Na 2-EDTA ，1mmolL -1的N-乙酰马来酰亚胺和0. 2mmol L -1苯基甲磺酰胺，p H7. 5，下同）中，取0. 5

13、mL 上Se p harose 4B 柱（0. 8×100cm ），用1mol L -1盐酸胍进行洗涤，计滴收集，每管收集30滴。层析洗脱收集液的监测：采用阿尔新兰染色斑点检测法。将层析过程收集的各管，各取510µL 点在醋酸纤维素薄膜上，用0. 1nmol L -1阿尔新兰液（内含1mol L -1乙醇、0. 17nmolL -1乙酸及0. 03mol L -1氯化镁）染色20min ，经4次漂洗后，晾干。剪下各斑点，溶于1. 5mL 二甲亚砜（内含0. 05mol L -1硫酸）中，37保温30min ，不断振摇，最后在677nm 下测定各斑点的吸光度。1. 5脑组织P

14、G 中糖胺多糖（GAG ）的双向电泳按文献6所述方法进行。2结果2. 1不同年龄脑PG 的提取颗粒性脑PG 的提取量，采用测定提取物中的己糖醛酸含量为指标。以己糖醛酸µg g -1脑湿重计4，不同年龄组颗粒性脑PG 的提取量和残渣保留量以及由此计算的提取率列于表1。7molL -1尿素液进行梯度洗脱，用阿尔新兰染色斑点法进行监测。3组颗粒性部分均可得到一个大的脑PG 洗脱峰。初生组和青年组均分布于0. 76molL -1NaCl 附近，而近老年组则分布于0. 64molL -1NaCl 附近，提示在近老年组，其颗粒性脑PG 分子中的负电荷量低于初生组和青年组。另外，青年组在0. 5m

15、ol L -1NaCl 附近还有一个较小的洗脱峰，近老年组依次在0. 33mol L -1Na-Cl 和0. 5molL -1NaCl 附近有两个较小的洗脱峰。经测定，这3个洗脱峰的蛋白质比例均在90%以上，可能是糖蛋白的洗脱峰（图1） 。（内含2期梁雪清，田梦玉. 不同年龄大鼠颗粒性脑蛋白聚糖的比较研究103水解液先用高浓度的NaCl 溶解，用3mol L -1乙并加热煮沸以沉淀除去其中的蛋酸调节至p H 5，白质，经离心后，所得上清用乙酸钠饱和乙醇沉淀其中的GAG ，经用无水乙醇及乙醚洗涤后得到干燥的GAG 样品。用适量的0. 6mol L -1NaCl 溶解GAG 样品，然后点样进行双向

16、电泳。电泳后薄膜上各染色斑点GAG 的种类用标准物共电泳的方法加以确定（图3），然后将各斑点剪下，溶于二甲亚砜（内含0. 05mol L -1硫酸）中，测定其677比例也有随年龄的增长而下降的趋势。表2颗粒性脑PG 经Se p harose 4B 柱层析后的GAG 组成（%）分组初生组青年组近老年组初生组青年组GAGCS 10084838889HA -1617-11HS -12-DS -组分nm 下的光吸收，进而计算出各种GAG 的百分含量，所得结果见表2 。图3峰GAG 的醋酸纤维素薄膜双向电泳由图3可见，在颗粒性脑PG 中，不仅含有硫酸软骨素（CS ）、透明质酸（HA ）和硫酸乙酰肝素HS

17、 ），而且还含有硫酸皮肤素（DS ），它们分布在分子大小不同的PG 洗脱峰中，表明在脑组织中不仅含有CSPG 和HSPG ，而且还含有DSPG ，甚至还含有两种GAG 糖链的杂化型PG 。由表2可见，CS 主要存在于分子比较大的峰和峰，而且与HA 共存，表明是大分子集聚型的CSPG ；HSPG 主要存在于分子比较小的峰中，有的在峰中也有少量；而DSPG 则主要存在于小分子的峰中，有的在峰也有少量。GAG 的年龄性变化最明显的是峰，它的DS 的比例随年龄增长而逐渐增高，而CS 的比例则随年龄增长而下降。此外，峰的CS 近老年组77914-初生组77-1013青年组69-2011近老年组77-71

18、6初生组61-39青年组58-42近老年组37-633讨论3. 1颗粒性脑PG 分子电荷的年龄性差异PG是一种具有负电荷的生物大分子，应用离子交换柱层析分析纯化PG ，主要是根据其负电荷的性质进行的。本研究在应用DEAE-Se p hacel 柱层析分离纯化脑PG 时，发现3组颗粒性部分均可获得一个脑PG 洗脱峰。但在近老年组，其脑PG 的梯度洗脱峰位置出现了明显前移现象，提示近老年组脑PG 分子的负电荷量明显低于其他各组。PG 的负电荷减少是组织老化的一种表现，这在软骨CSPG 的研究中已得到证实。但其机理尚不清楚，可能是由于催化转录后糖基化和硫酸化的酶类活性发生改变，致使糖链和硫酸化程度有

19、所降低。我们曾分析了3种脑PG 的己糖醛酸/蛋白质比例，发现近老年组均低于其他两组，这可能是其负电荷降低的一个因素。要完全明确颗粒性脑PG 负电荷降低的原因，需进一步分析其GAG 糖链的特点，包括糖链的组成、分子大小以及硫酸化的程度等。3. 2颗粒性脑PG 的分子大小和种类及其年龄性差异3组颗粒性脑PG 经过Se p harose 4B 柱层析后，可按分子质量大小分为4部分，即峰、峰、峰、峰。峰是属于大分子的CSPG ；峰主要也是CSPG ，但分子质量略小；峰以HSPG 为主；峰以小分子DSPG 为主，但尚不能排除既含DS 链又含CS 链的杂化型小分子PG 。此外，CS 在4个峰中均含有一定比

20、例，表明脑中的CSPG 可能存在着几种分子大小不同的类型。由于在提取分离的各个阶段均应用了各种蛋白酶抑制剂，故可排除核心蛋白水解的可能性。Mar g olis 等总结了国（104西安交通大学学报（医学版）第24卷外不同学者从脑组织中鉴定的约10余种CSPG ，其相对分子质量范围相当大，从6070kD 到5。由此可见，存在于脑组织中的PG ，680kD 不等不仅种类较多，而且同一种类型的PG 也还有不同CS 比例则逐渐下降。综上所述，颗粒性脑PG 随动物年龄的增长发生一定的变化，与脑的发育和老化有密切关系。本研究为进一步探讨脑PG 的结构、功能及其在发育和老化中的变化机理提供了较为重要的线索和依

21、据。参考文献：1Sobel RA ，Ahmed AS. White matter extracellular matrixchondroitin sulfate 7dermatan sulfate 8roteo 9l :cans in multi; （12）：. <=euro8athol >x8=eurol，2001，608le sclerosis <1198-1207.2?hun 9A，Beun 9C，Bin B ，et al . De 8aran sulfate 8roteo;. 9l :can ex 8ression in the o 8tic chiasm of mo

22、use embr :os <（2）： x;1986，62：347-362. 8l ?ell Res ，6?alson SS. S :na 8tic Gesicle 9l :co 8roteins and 8roteo 9l :cans in. =eJAorH ：Flenum neurobiolo 9:of 9l :cocon I u 9ates C Fress ，1989. 309-336.（编辑卓选鹏）的分子类型。进一步研究这些复杂多样PG 的分子特点以及它们的功能，可能具有重要意义。3组颗粒性脑PG 的年龄性差异比较明显的主要有以下几个方面：从各洗脱峰的分布比例来看，初生组和青年组大部分集中于大分子的峰，分别为53%和73%；而中等分子和低分子洗脱峰的比例都比较小。与此相反，近老年组的峰比例最小，为17%，而峰的比例却较其他两组约高2倍以上，峰和峰也高