硅胶_环糊精固定金属离子亲合吸附剂的制备及性能

1、第17卷第2期化学研究Vol.17No.2 2006年6月CHE M I CALRESE ARCH Jun.2006硅胶2环糊精固定金属离子亲合吸附剂的制备及性能叶青1,张世秀2,段天宝1,叶文玉13(1.河南大学化学化工学院,河南开封475001;2.河南省医药学校,河南开封475001摘要:以硅胶键合2环糊精(2CD为载体,亚氨基二乙酸(I D A为螯合基,制备了新型固定金属离子亲合吸附剂.通过13C固体核磁、元素分析对其进行了表征.每克吸附剂分别含I D A分子158mol,2C D分子136mol.研究了吸附剂对2淀粉酶的吸附特性.关键词:亲合吸附剂;硅胶;2环糊精;2淀粉酶中图分类号

2、:O647.33文献标识码:A文章编号:1008-1011(200602-0053-04Preparati on and Properti es of I mmobili zed M et al I on Affi n ityAdsorbent Based on Sili ca Gel2Cyclodextr i nYE Q ing1,ZHANG Shi2xiu2,DUAN Tian2bao1,YE W en2yu13(1.College of Che m istry and Che m ical Engineering,Henan U niversity,Kaifeng475001,Henan

3、,China;2.Phar m aceutical School of Henan Province,Kaifeng475001,Henan,ChinaAbstract:A ne w i m mobilized metal affinity(I M Aads orbent was p repared by2cycl odextrin(2CDbonded silica gel with i m inodiacetic acid(I D Aas ligand.The p repared ads orbent was characterizedby s olid state13C CP/MAS NM

4、R and elemental analysis.The I D A and CD contents in the ads orbentwere deter m ined t o be158mol/g and136mol/g,res pectively.The ads or p ti on capability of the ad2s orbent t o2a mylase was als o studied.Keywords:affinity ads orbent;silica gel;2cycl odextrin;2a mylase固定金属离子亲合吸附剂(I M A由载体、螯合基和金属离子

5、三部分组成,利用材料上固定的金属离子与蛋白质表面的组氨酸残基配位结合,选择性地吸附蛋白质,在蛋白质固定和分离方面有广泛应用1,2.载体的物理化学性质显著影响着吸附效果,多糖类软基质载体,生物相容性好,吸附量大,但机械强度小,稳定性差,难以用于加压体系3,4;无机硅胶类载体,机械强度高,但耐碱性差,吸附量小,硅羟基非特异吸附强5.在硅胶表面键合有机层,钝化硅羟基,创造温和的接触表面,有望制备一种兼具高吸附量和高机械性能的吸附剂.Xi6等将壳聚糖涂敷于硅胶表面制备了新型I M A材料,显示了对胰岛素的强吸附.环糊精与蛋白质的作用已有广泛研究7.蛋白质表面的氨基酸能部分嵌入环糊精空腔中,产生弱的包合

6、作用,减弱氧气,溶剂分子的作用,有利于保持蛋白质的活性.环糊精分子易于进行多种衍生化8,9,衍生化硅胶2环糊精填料已被应用于高效液相色谱中10,但作为I M A载体还未见报道.作者首次制备了硅胶2环糊精为载体的固定金属离子吸附剂,选用2淀粉酶为标准蛋白,考察了吸附剂的吸附性能.1实验部分1.1仪器和试剂I nfinity p lus300WB型固体核磁共振仪(天津大学分析测试中心,观测频率为75MHz;PE22400型元素收稿日期:2006-01-11.基金项目:河南省科技攻关项目(0424270066.作者简介:叶青(1979-,男,硕士,从事高分子功能材料性能研究.3通讯联系人,Email

7、:hdye wenyu.54化学研究2006年分析仪;Shi m adzu UV 2250型紫外2可见分光光度计.国产721型分光光度计.Z CX 23硅胶(粒径4575m ,比表面积200300m 2/g,孔径812nm ,青岛海洋化工厂,使用前在稀盐酸中活化5h,用水洗至中性,真空干燥备用;2环糊精(2CD ,上海化学试剂公司,使用前重结晶,真空干燥48h;2氯丙基三乙氧基硅烷(武汉大学化工厂,使用前重蒸;N ,N 2二甲基甲酰胺(DMF 使用前用无水硫酸镁和分子筛干燥,蒸馏收集145馏分,密封待用;2淀粉酶(Sig ma 公司,其它试剂均为国产分析纯试剂.酶溶液的蛋白质浓度用紫外光谱吸收

8、差法11测定:c =1.45×A 280-0.74×A 260(1c 为滤液中蛋白质的质量浓度(g /L ,A 280,A 260为蛋白溶液在280nm 和260nm 的吸光度值.1.2吸附剂的制备Si O 22CD 载体的制备:活化硅胶20g 分散于300mL 无水甲苯中,加入8mL 2氯丙基三乙氧基硅烷,氮气保护下110反应8h 后降至室温,固体产物(Si O 22Cl 抽滤,依次用DMF 、甲苯、水洗涤,真空干燥48h 备用.取5g 干燥的2CD 溶于50mL 无水DMF 中,加入0.5g NaH 反应0.5h,滤去不溶物,滤液中加入Si O 22Cl 再缓慢升温至9

9、0反应24h,产物(CD 2Si O 2抽滤,固体依次用DMF 、水洗涤,真空干燥48h 备用.固体中2CD 的含量用分光光度法测定12.I D A 螯合基的连接:取上述Si O 22CD 载体20g 分散于pH 值为9的碳酸钠溶液中,缓慢滴加10mL 环氧氯丙烷,50活化12h,产物过滤,固体立即转入pH 值为11的氢氧化钠溶液(含30%二氧六环中,再加入3g 亚氨基二乙酸,1mg 硼氢化钠,70反应24h,产物用去离子水浸泡24h,再用乙醇、水各洗3次,除去未键合的小分子,真空干燥48h,得白色固体粉末(I D A 2CD 2Si O 2.金属离子的固定:将I D A 2CD 2Si O

10、2浸入金属盐溶液中,充分搅拌10h .然后用磷酸盐(pH7.0、柠檬酸盐(pH 5.0和磷酸盐(pH 7.0缓冲溶液依次洗5次以彻底除去未固定的金属离子.分别制得固定Cu 2+,N i 2+,Zn 2+,Co 2+.吸附剂的制备路线见图1. 图1吸附剂的制备路线Fig .1The p reparati on r oute of the ads orbent1.3淀粉酶吸附实验在4支5mL 试管中分别加入50mg 固定Cu 2+,N i 2+,Zn 2+,Co 2+四种金属离子的吸附剂,再加入1mL 1g/L 的淀粉酶的磷酸盐缓冲溶液,充分震荡1h,离心,测定上层清液中剩余蛋白的浓度.吸附剂对2

11、淀粉酶的吸附效果,以吸附率表示,其定义如(2式:R =(A o -A e /A o ×100%(2其中R 为2淀粉酶的吸附率,A o ,A e 分别为溶液中的初始蛋白含量和吸附平衡时上清液的游离蛋白含量,单位g .另取8支试管,分别加入100mg 固定Cu 2+的吸附剂,再加入1mL 不同浓度的2淀粉酶的磷酸盐缓冲溶液,25恒温振荡1h,离心,测定上层清液蛋白质浓度,根据物料平衡绘制吸附等温线.第2期叶青等:硅胶2环糊精固定金属离子亲合吸附剂的制备及性能552结果与讨论2.1吸附剂的制备与表征首先用2CD 、硅烷偶联剂与活化硅胶作用,在硅胶表面上锚接2CD 分子,然后对CD 上未反应

12、的羟基进行环氧活化,键合能与金属配位的螯合基,常用的螯合基有亚氨基二乙酸(I D A 、三羟基乙二胺(TE D 、乙二胺二乙酸(EDDA 等1,这些多齿配体分子中配位原子数小于金属离子的配位数,固定Cu 2+,Zn 2+,N i 2+,Co 2+等二价金属后,金属离子能为蛋白质提供13个配位结合点.作者选用最常用的I D A 为螯合基.键合硅胶材料由于有机成分一般较少,红外峰被硅羟基的强吸收掩盖,表征困难.本实验采用元素分析和固体核磁共振法对制备的吸附剂进行了表征.元素分析结果见表1.在优化反应条件下,吸附剂含碳量约8%,由含氮量推算出I D A 2CD 2Si O 2中I D A 的含量为1

13、58mol/g,由分光光度法测定I D A 2CD 2Si O 2上2CD 的含量为136mol/g,I D A 与CD 摩尔比为1.16,即每个2CD 分子上键合约1个I D A 分子.表1C D 2Si O 2和I D A 2C D 2Si O 2的元素分析数据表Table 1The ele mental analyses of the matrix (C D 2Si O 2and ligand coup led matrix (I D A 2CD 2Si O 2Ads orbentw (C (%w (H (%w (N (%I D A density (mol/g 2CD density

14、3(mol/g C D 2Si O 27.521.760.000144I D A 2CD 2Si O 28.051.820.221581363The 2CD a mounts were deter m ined by s pectr ophot ometry methods在I D A 2CD 2Si O 2的固体核磁碳谱中,60105处出现环糊精结构单元中C1C6的碳峰,证明2CD 分子的筒状结构在修饰过程中未受破坏,高场1035处出现的宽峰,对应于硅烷偶联剂碳桥上的亚甲基,低场175处出现羰基碳的峰,同时55,48处出现与氮原子相连的多个亚甲基峰证明成功引入了I D A 螯合基. 图2I

15、D A 2C D 2Si O 2的13C 固体核磁图谱Fig .213C CP /MAS NMR s pectra of ID A 2C D 2Si O 22.2金属离子的影响图3I D A 2C D 2Si O 2固定不同金属离子后对2淀粉酶的吸附效果Fig .3Ads or p ti on efficiency of I D A 2CD 2Si O 2i m mobilized with different metal i ons t o 2a mylase在相同条件下考察了I D A 2CD 2Si O 2分别固定四种二价金属离子后对2淀粉酶的吸附能力,如图3所示,固定铜离子的吸附剂吸附

16、能力最强,平衡时90%以上的2淀粉酶被吸附.蛋白质与金属的配合是通过蛋白质表面的组氨酸残基氮原子上的孤对电子与金属离子上的空杂化轨道结合形成的,常用的几种金属离子Cu 2+,N i 2+,Zn 2+和Co 2+具有相同电荷,与2淀粉酶形成的络合物稳定性呈现出Cu 2+>N i 2+>Zn 2+>Co 2+的排列次序,和四种金属离子的半径大小次序相反,而金属离子半径越小配位作用越强.2.32淀粉酶的等温吸附通过研究在25时Cu 2+2I D A 2CD 2Si O 2在不同浓度淀粉酶溶液中的吸附性能,得到如图4所示的吸附等温线.从图4中可56化学研究2006年以看出,蛋白质浓度

17、较低时,吸附量随浓度增加迅速上升;随着溶液中蛋白质浓度的升高,吸附量增加变缓,并趋向于达到最大吸附值19.5mg/g.同时在图中还可以看到CD2Si O2载体在所有酶浓度下均未呈现出对2淀粉酶的有效吸附,这说明2淀粉酶的吸附是由酶和固定的铜离子配位而产生的特异吸附.对图4数据使用Lang muir方程进行拟合,如(3式:c3/q=c3/q m+1/q m(3其中c3为吸附平衡时溶液中的蛋白质浓度,g/L;q和qm分别为平衡吸附量和最大吸附量,mg/g.以c3/q对c3作图,可得图5所示拟合直线,线性相关系数为0.995,通过直线斜率和截距得到吸附等温方程,最大吸附量qm为20.8mg/g,与实

18、验结果19.5mg/g相近,说明吸附过程属于Lang muir吸附. 图425时2淀粉酶的等温吸附线Fig.4Ads or p ti on is other m of2a mylase at25图52淀粉酶等温吸附Lang muir拟合直线Fig.5Ads or p ti on is other m of2a mylasebased on the Lang muir Equati on参考文献:1Ueda E KM,Gout P W,Morgantia L.Current and p r os pective app licati ons of metal i on2p r otein bin

19、dingJ.J Chro m atogr A,2003,988:1-23.2Kara A,O s man B,Yavuz H,et al.I m mobilizati on of2a mylase on Cu2+chelated poly(ethylene glycol di m ethacrylate2n2vinyli m idazolematrix via ads or p ti onJ.React Funct Polym,2005,62:61-68.3Zachari ou M,Hearn M T W.Ads or p ti on and selectivity characteristi

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