脂质体电动色谱法评价阿魏酸与生物膜的相互作用

1、脂质体电动色谱法评价阿魏酸与生物膜的相互作用        【摘要】     利用脂质体与生物膜结构的相似性，将脂质体加入毛细管电泳缓冲溶液中作为假固定相，在数分钟内测定了阿魏酸的脂水分配系数Klw，建立了脂质体电动色谱评价阿魏酸与生物膜相互作用的方法。研究了脂质体中胆固醇的含量、缓冲溶液pH值和缓冲体系对Klw的影响。结果表明，在实验条件范围内（胆固醇含量030%，pH值4.012.0），胆固醇含量升高，缓冲溶液pH值增大，Klw降低；在不同的缓冲体系中，离子强度

2、越大，Klw越大。脂水分配系数的变化反映了阿魏酸与生物膜相互作用。     【关键词】  脂质体电动色谱 阿魏酸 生物膜 脂水分配系数    1  引言    药物与生物膜的相互作用在定量结构活性关系（quantitative structure activity relationship，QSAR）中应用广泛，已成为一个重要的研究领域1。而脂质体是一种合适的生物膜模型，药物在脂质体相和水相的分配系数（Klw）可作为评价药物膜相互作用的尺度，提供某种药物透过生物膜难

3、易程度的信息25。传统测定Klw方法较繁琐、耗时，且需要高纯度和大体积的样品。    脂质体电动色谱（LEKC）61结合了脂质体同生物膜结构的相似性和毛细管电泳的快速高效性，在研究药物与生物膜相互作用中表现出了巨大的优势。如简便、快速、自动化和微量。应用LEKC测定Klw仅需几分钟，而传统方法需几小时甚至几天。Zhang等首先尝试用LEKC分析药物与生物膜相互作用。Burns建立了线形溶解能关系式（linear solvation energy relationship， LSER），揭示了各种不同类型的作用力对药物进入脂质体的贡献。Carrozzino，研究了缓

4、冲液pH值及缓冲体系对碱性药物Klw的影响。而酸性药物阿魏酸Klw的测定及影响因素尚未见报道。本研究采用LEKC方法快速测定了阿魏酸的Klw，同时考察了脂质体中胆固醇的含量，缓冲溶液的pH值和缓冲体系对阿魏酸Klw的影响。2  实验部分2.1  仪器与试剂    P/ACETM MDQ 型高效毛细管电泳系统(Beckman Coulter，USA)， 配有二极管阵列检测器(DAD) 及仪器操作和数据采集软件(32 Karat Software)；未涂敷熔融石英毛细管， 60 cm (有效长度50 cm)×50 m i.d. (河北永年

5、光导纤维厂)；pHS25型酸度计(上海虹益仪器仪表有限公司)。阿魏酸(Sigma 公司)； 胆固醇（北京奥博星生物技术有限公司）；卵磷脂（serva 公司）；所用水为二次蒸馏水；其它试剂均为分析纯； 0.45 m微孔滤膜（上海新亚净化仪器厂）。2.2  脂质体的制备    称取一定量卵磷脂和胆固醇于50 mL圆底烧瓶中，加10 mL有机溶剂（氯仿）（甲醇）=9010）使其充分溶解。置于旋转蒸发仪中，于65 在最大转速时旋转减压蒸去溶剂，可见一层透明的膜附着于烧瓶上，真空干燥过夜。在所得产物中加入10 mL 10 mmol/L 缓冲溶液，将圆底烧瓶置于65

6、 热水浴中旋涡水合2 h后超声40 min，定容至10 mL。2.3  电泳条件    检测波长：214 nm；压力进样：3.47 kPa×5 s；温度：25 ；电压：24 kV；运行缓冲液为10 mmol/L磷酸盐或含脂质体的磷酸盐或其它缓冲体系。实验时毛细管用0.1 mol/L NaOH冲洗3 min，再用纯水冲洗2 min，最后用背景缓冲液冲洗5 min。每次更换缓冲液时均用新缓冲液清洗5 min。样品进样前需超声以脱气，过0.45 m 滤膜, 以保证实验的重复性。2.4  溶液的配制    精确称

7、取阿魏酸10 mg，置于10 mL容量瓶中以甲醇定容，用微量移液器吸取0.5 mL移入5 mL容量瓶中，再以甲醇定容，制得浓度为100 mg/L的样品溶液。    2.5  计算方法    脂质体与生物膜的结构相似性为LEKC描述药物膜相互作用提供了物质基础，药物在含有脂质体溶液毛细管中的迁移时间与不含脂质体溶液中的迁移时间的变化能够反映药物与膜的相互作用。迁移时间取重复3次的平均值。LEKC的容量因子（k）涵盖了药物与脂质体的疏水、静电及其它氢键、空间位阻等作用。Klw代表了溶质在脂质体相和水相的分配，可用来描述与脂质体结

8、合的程度，进而评价药物与膜的相互作用。药物在LEKC上的容量因子与脂水分配系数成线性比例，利用公式(1)(4)可计算LEKC中药物的容量因子（k）、脂水分配系数(k)和吉布斯自由能变化值（）4,11。k（tt）/t（）k为容量因子，t为毛细管电泳缓冲溶液含脂质体时(即脂质体电动色谱，LEKC)药物的迁移时间，t则为缓冲溶液无脂质体时（即毛细管区带电泳，capillary zone electrophoresis， CZE）药物的迁移时间。k=Klwlw(VlipVaq)=Klwv（)（v*（）（）v=（x×v）（）为相比，v 为总的偏摩尔特征体积（据式3计算），P为脂质体总浓度，CA

9、C 为临界聚集浓度，接近于01，x 为脂质体中各种组分的摩尔百分比。v为脂质体中各种组分的偏摩尔特征体积，参照文献1，1计算。 gTln（tt）（）Rg为标准气体常数，T为热力学温度。3  结果与讨论3.1  胆固醇含量对Klw的影响    在脂质体制备过程中加入不同比例的胆固醇，阿魏酸的Klw的对数值如图1所示。胆固醇含量为0、10%、20%和30%时，lgKlw值分别为2.44、2.40、2.33和2.25。可以看出，Klw在脂质体无胆固醇时最大，且随着脂质体中胆固醇含量的增加而减小。    

10、0; 图1  胆固醇含量对lgKlw的影响（略）Fig.1  Effect of cholesterol contents on lgKlw缓冲液（buffer）：10 mmol/L磷酸盐(phosphate)，pH 7.0。胆固醇含量由0变化到30%，由式（2）和式（3）计算得知，相比的变化可忽略，故影响Klw的主要因素为阿魏酸在CZE和LEKC中迁移时间。而迁移时间的变化反映了药物与生物膜的相互作用。胆固醇像“缓冲剂”一样起着调节生物膜结构流动性的作用。胆固醇本身不形成脂质双层结构，但它能以高浓度方式掺入磷脂膜，引起膜性质的变化。胆固醇分子在双层中的取向是其羟基紧靠磷脂

11、分子的极性头部，其板状的固醇环紧接极性头部的碳氢链区域，并与之相互作用。随着脂质体中胆固醇含量的增加，酰基链的自由度降低，从而使得脂质双层排列更加紧密，脂质体的刚性和有序性增加，流动性降低，故药物进入脂质体难度增加，分配进入脂质体的量减少，即Klw减小。3.2  缓冲溶液pH值对Klw的影响    毛细管壁硅醇基的解离常数1为1.0×10-3，故pH    不同pH缓冲液中阿魏酸的吉布斯自由能变化值如图2b所示。G随缓冲溶液的pH值的增大而增大。G越小，说明药物与脂质体的相互作用越强，药物更易进入生物膜内。

12、0; 图2  缓冲液pH值对Klw(a)和(b)的影响（略）Fig.2  Effect of pH on Klw (a) and （b） of ferulic acid缓冲液（buffer): 10 mmol/L 磷酸盐(phosphate)。3.3  缓冲体系对Klw的影响    阿魏酸在硼酸盐、磷酸盐和Tris(三羟甲基胺基甲烷)缓冲溶液中CZE和LEKC谱图如图3所示。图中为阿魏酸在CZE中的峰位置， 2为阿魏酸在LEKC中的峰位置。缓冲液pH值为7.0，浓度均为10 mmol/L。从图3中可以看出阿魏酸在相同浓度不同缓冲体系中

13、迁移时间差别较大。测试方式为CZE时，阿魏酸在硼酸盐、磷酸盐和Tris缓冲溶液中的迁移时间分别为13.13、3.82和5.94 min。测试方式为LEKC时，阿魏酸的迁移时间分别为19.41、5.29和7.49。硼酸盐、磷酸盐和Tris缓冲溶液中阿魏酸Klw的对数值分别为2.32、2.23和2.05。硼酸盐缓冲液中Klw值最大，其次为磷酸盐和Tris缓冲溶液，这可能与缓冲溶液离子强度有关。3种缓冲溶液在相同浓度下调节pH后，离子强度大小为：硼酸盐>磷酸盐>Tris。阿魏酸的Klw值随缓冲溶液的离子强度的增大而增大。Carrozzino10发现在LEKC中，带正电荷的溶质随着离子强度

14、的增大，分配系数减小。这与本实验结果是一致的。图3  阿魏酸的（）和（）在不同缓冲液中的图谱（略）ig.3  Capillary zone electrophoresis (CZE) (1) and liposome electrokinetic chromatogram (LEKC)(2) of ferulic acid in different buffera: 10 mmol/L硼酸盐(borate), pH 7.0; b: 10 mmol/L磷酸盐(phosphate), pH 7.0; c: 10 mmol/L tris, pH 7.0。这是因为缓冲溶液的离子不仅

15、对溶质分子的电荷起屏蔽作用，而且对脂质体表面的电荷也有屏蔽作用。溶质带正电荷时，缓冲溶液的离子屏蔽了溶质的正电荷和脂质体的负电荷，削弱了溶质和脂质体的静电作用，分配系数减小。而在本实验条件下（pH7.0），溶质带负电荷，缓冲溶液的离子屏蔽了溶质的负电荷和脂质体的负电荷，减弱了溶质和脂质体的排斥作用，两者之间的结合程度增大，故分配系数增大。3.4  结论    实验结果表明，胆固醇的加入降低了脂质体的流动性，使药物在脂质体中的分配减小，Klw降低。缓冲溶液pH升高，阿魏酸的解离程度增大，与脂质体相互作用减弱，Klw降低。pH7.0时，在3种缓冲体系中（硼酸

16、盐、磷酸盐和Tris溶液），离子强度越大，离子对药物和脂质体的负电荷的屏蔽作用越强，减弱了药物与脂质体的排斥作用，Klw升高。    【参考文献】  1 Raevsky O A, Schaper K J. Eur J Med Chem, 1998, 33(10): 7998072 Yang Q, Liu X Y, Umetani K. Bio. Acta, 1999, 1417(1): 1221303 Wang Zhiuan(王志宣), Deng Yingie（邓英杰）, Zhang Xiaoeng（张晓鹏）. Chinese J. Acta

17、Pharm. Sin(药学学报), 2006, 41 (4): 3183224 Sheng LiangHong(盛亮洪), Li Ping(李 萍), Zou HanFa(邹汉法). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学), 2005, 33(1): 13165 Sun Yue(孙 悦), Yin XueFeng(殷学锋), Lu Min(卢 敏). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学), 2007, 35(4): 4694736 Zhang Y, Zhang R, Hjertén S, Lundahl P. Electrophoresis, 1

18、995, 16(1): 151915237 Burns S T, Agbodjan A A, Khaledi M G. J.Chromatogr. A, 2002, 973(12): 1671768 Wiedmer S K, Jussila M S, Holopainen J M, Alakoskela J M, Kinnunen P K J, Riekkola M L. J.Sep. Sci, 2002, 25(7): 4274379 Carrozzino J M, Khaledi M G. J Chromatogr A, 2005, 1079(12): 30731610 Carrozzino J M, Khaledi M G. Pharm. Res., 2004, 21(12): 2327233511 Wang Yongun(王永军), Sun Jin(孙 进), He Zhongui(何仲贵). Chinese J. Acta Pha