烟草青枯病ppt课件

1、烟草青枯病烟草青枯病黄俊斌黄俊斌 教授教授刘海龙刘海龙 黎妍妍黎妍妍研讨背景研讨背景 烟草是一种重要的经济作物，是烟区人民脱贫致富的主要经济来源，但是烟草的病害发生严重，尤其是烟草青枯病，几乎分布于世界上一切烤烟种植区。 烟草青枯病是由茄科雷尔氏菌Ralstonia solanacearum引起,1864年在印度尼西亚首先报道。该病在我国长江流域及其以南烟区普遍发生，其中以广东、福建、台湾、湖南、湖北、江西、广西东部、安徽南部、四川及贵州部分烟区为害严重，个别年份经常迸发流行，呵斥消灭性损失。一、病症一、病症正常萎蔫 典型病症是叶片萎蔫，部分叶片变黄，茎上出现长形黑褐典型病症是叶片萎蔫，部分叶

2、片变黄，茎上出现长形黑褐色条斑，有的条斑扩展到病株顶部，根部变黑腐烂。色条斑，有的条斑扩展到病株顶部，根部变黑腐烂。枯萎茎干变褐叶肉病变茎干变褐 研讨内容研讨内容二、病原菌的分别和鉴定二、病原菌的分别和鉴定 1. 1.病原菌的分别病原菌的分别 采用稀释划线分别法。采用稀释划线分别法。 将烟草病株基部的茎杆外表用清将烟草病株基部的茎杆外表用清水洗净晾干，水洗净晾干，7575的酒精外表消毒，在含有的酒精外表消毒，在含有无菌水的培育皿中研磨病组织。用移菌环蘸无菌水的培育皿中研磨病组织。用移菌环蘸取少量菌液在取少量菌液在TTCTTC培育基青枯菌选择培育培育基青枯菌选择培育基上划线，基上划线，3030培

3、育培育48h48h。 TTC TTC平板培育平板培育48h48h后青枯菌菌株的菌落形状后青枯菌菌株的菌落形状TTCTTC培育基：培育基：NANA培育基中参与三苯基四氮唑培育基中参与三苯基四氮唑TTCTTC. .烟草青枯菌分别菌株来源烟草青枯菌分别菌株来源菌株烟草品种地理来源菌株烟草品种地理来源XE1-1云烟87宣恩县晓关镇XF3-1毕纳1号咸丰县忠堡镇XE1-2云烟87宣恩县晓关镇XF3-2毕纳1号咸丰县忠堡镇XE2-1毕纳1号宣恩县晓关镇RS1-1云烟87巴东县大支坪镇XE2-3毕纳1号宣恩县晓关镇RS1-2云烟87巴东县大支坪镇XE2-4毕纳1号宣恩县晓关镇RS1-3云烟87巴东县大支坪镇

4、XE3-2云烟87宣恩县晓关镇RS1-4云烟87巴东县大支坪镇XE3-3云烟87宣恩县晓关镇RS2-1云烟87恩施市盛家坝乡XE3-4云烟87宣恩县晓关镇RS2-2云烟87恩施市盛家坝乡XE4-1云烟87宣恩县晓关镇RS3-2云烟87恩施市三岔乡XE4-2云烟87宣恩县晓关镇RS3-3云烟87恩施市三岔乡XE5-1云烟87宣恩县晓关镇RS4-1云烟87恩施市盛家坝乡XE5-2云烟87宣恩县晓关镇RS4-2云烟87恩施市盛家坝乡XE5-3云烟87宣恩县晓关镇RS6-1云烟87恩施市龙凤镇LC1-2云烟87利川市柏杨坝镇RS6-2云烟87恩施市龙凤镇LC1-4云烟87利川市柏杨坝镇RS6-3云烟8

5、7恩施市龙凤镇LC1-5云烟87利川市柏杨坝镇RS5-1云烟87来凤县旧司乡LC1-6云烟87利川市柏杨坝镇RS5-2云烟87来凤县旧司乡LC2-1云烟87利川市柏杨坝镇RS5-3云烟87来凤县旧司乡LC2-2云烟87利川市柏杨坝镇RS5-4云烟87来凤县旧司乡LC2-3云烟87利川市柏杨坝镇RS7-1云烟87鹤峰县燕子乡LC2-4云烟87利川市柏杨坝镇RS7-2云烟87鹤峰县燕子乡XF1-1毕纳1号咸丰县忠堡镇RS7-3云烟87鹤峰县燕子乡XF1-2毕纳1号咸丰县忠堡镇RS7-4云烟87鹤峰县燕子乡XF1-3毕纳1号咸丰县忠堡镇RS8-1鄂烟1号建始县高坪镇XF2-1毕纳1号咸丰县忠堡镇RS

6、8-2鄂烟1号建始县高坪镇XF2-2毕纳1号咸丰县忠堡镇RS8-3鄂烟1号建始县高坪镇XF2-3毕纳1号咸丰县忠堡镇RS8-4鄂烟1号建始县高坪镇2 病原菌的纯化和保管病原菌的纯化和保管 从从TTC培育基上挑取呈不规那么圆形，培育基上挑取呈不规那么圆形，中心淡粉红色，周围白边较宽，流动性强的中心淡粉红色，周围白边较宽，流动性强的单菌落进展纯化，单菌落进展纯化，2-3次后，用接种环挑取次后，用接种环挑取少量细菌于灭菌水中少量细菌于灭菌水中20保管。保管。3 青枯菌的分子鉴定青枯菌的分子鉴定 经过常规经过常规PCR，利用青枯菌种的特异，利用青枯菌种的特异性引物性引物759760，对分别获得的菌株进

7、展分，对分别获得的菌株进展分子鉴定，根据扩增结果来确定能否为青枯菌。子鉴定，根据扩增结果来确定能否为青枯菌。 引物序列：759 ：GTCGCCGTCAACTCACTTTCC 760：GTCGCCGTCAGCAATGCGGAATCG PCR扩增采用25L反响体系，其中10PCR buffer 2.5L，Taq酶2U，MgCl21.5mM，dNTPs200M，引物759和760各1L，DNA 5L。 反响程序为：952 min； 9420s， 30 6830s， 7230s； 72延伸10min。 3.青枯菌的分子鉴定结果青枯菌的分子鉴定结果 扩增结果阐明：一切分别获得的供试青枯菌菌株均可扩增得到

8、280bp左右的特异性片段。 分别菌株的特异性分别菌株的特异性PCR鉴定结果鉴定结果注：1-22、24-46分别的烟草青枯菌；23：阴性对照；M：1000bp Marker自上而下片段大小分别为：1000bp，700bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp280bp280bp280bp三、烟草青枯菌菌系分化研讨三、烟草青枯菌菌系分化研讨1.青枯菌生理小种鉴定青枯菌生理小种鉴定供试菌株：从湖北恩施地域烟草青枯病病株上供试菌株：从湖北恩施地域烟草青枯病病株上分别的分别的54个青个青 枯菌菌株。枯菌菌株。鉴别寄主：烟草、番茄、茄子、马铃薯、花生鉴别寄主：烟草、番茄、茄子、马铃

9、薯、花生和辣椒和辣椒接种方法：接种方法：1mL细菌悬浮液浓度为细菌悬浮液浓度为108cfumL ，注射到，注射到5- 7叶期的寄主茎基部。叶期的寄主茎基部。培育条件：温度培育条件：温度30，相对湿度，相对湿度80%以上。以上。小种划分：接种小种划分：接种7天后，调查接种植株的抗感天后，调查接种植株的抗感反响，根据反响，根据Budenhagen、华静月等人制定的、华静月等人制定的生理小种划分规范，确定菌株的生理小种归生理小种划分规范，确定菌株的生理小种归属。属。 青枯菌的生理小种划分标准青枯菌的生理小种划分标准小种侵染植物1号茄科植物（包括番茄、马铃薯、烟草、辣椒、茄子等）和其他科植物2号香蕉、

10、大蕉和海里康（Heliconia）3号马铃薯和番茄、茄子（偶尔侵染）4号姜，番茄、马铃薯（致病力很微弱）5号桑（致病性很强）；番茄、马铃薯、茄子、龙葵和辣椒（致病力很微弱） 烟草青枯菌接种生理小种鉴别寄主烟草青枯菌接种生理小种鉴别寄主 鉴定结果阐明：54个烟草青枯菌菌株接种6种鉴别寄主均能使其致病，发病率均为100%，侵染的植物种类范围符合生理小种1号的侵染范围，因此可将供试菌株划分为生理小种1号。 2.烟草青枯菌生化型测定烟草青枯菌生化型测定 根据菌株对根据菌株对3种双糖乳糖、麦芽糖、纤维种双糖乳糖、麦芽糖、纤维二糖和二糖和3种己醇甘露醇、山梨醇和甜醇种己醇甘露醇、山梨醇和甜醇的利用程度，将

11、菌株划分为不同的生化型。的利用程度，将菌株划分为不同的生化型。测试项目生化型甘露醇山梨醇甜醇乳糖麦芽糖纤维二糖注：“+代表能利用培育基变黄，“代表不能利用蓝色青枯菌生化型划分规范青枯菌生化型划分规范 根据何礼远、华静月等提出的青枯菌5型划分规范，对分别菌株进展生化型划分，规范如下： 生化型测定结果阐明：54个烟草青枯菌菌株均能利用3种双糖和3种己醇，根据青枯菌生化型划分规范鉴定均为生化型。甜醇山梨醇甘露醇纤维二糖乳糖麦芽糖 菌株对菌株对3 3种己醇和种己醇和3 3种双糖的利用左为种双糖的利用左为CKCK，右为接菌，右为接菌3.3.烟草青枯菌演化型鉴定烟草青枯菌演化型鉴定 参照参照FeganFe

12、gan和和PriorPrior的方法，用的方法，用7 7条引物扩条引物扩增青枯菌株增青枯菌株DNADNA，根据扩增的片段大小确定供，根据扩增的片段大小确定供试菌株的演化型。试菌株的演化型。用于演化型鉴定的引物序列用于演化型鉴定的引物序列引物序列Sequence（5-3）扩增片段分类归属片段大小Nmult21:1FCGTTGATGAGGCGCGCAATTT演化型144bpNmult21:2FAAGTTATGGACGGTGGAAGTC演化型372bpNmult23:AFATTACSAGAGCAATCGAAAGATT演化型91bpNmult22:InFATTGCCAAGACGAGAGAAGTA演化型

13、213bpNmult22:RRTCGCTTGACCCTATAACGAGTA-759GTCGCCGTCAACTCACTTTCC青枯菌种特异性280bp760GTCGCCGTCAGCAATGCGGAATCG- DNA提取：用TaKaRa试剂盒提取菌株的DNA。 PCR扩增采用25L反响体系，其中包括： 10PCR buffer 2.5L， Taq酶2U， MgCl21.5mM， dNTPs 200M， 引物759和760各4pmol，引物Nmult21:1F，Nmult21:2F，Nmult23:AF， Nmult22:InF，Nmult22:RR各6pmol， DNA模板50ng。 反响程序为：

14、 965 min； 9415s， 30 5930s， 7230s； 72延伸10min。 取5LPCR产物于2%的琼脂糖凝胶中电泳，电压5Vcm，经过Biorad凝胶成像仪察看结果。 反响程序为： 965 min； 9415s， 30 5930s， 7230s； 72延伸10min。 取5LPCR产物于2%的琼脂糖凝胶中电泳，电压5Vcm，经过Biorad凝胶成像仪察看结果。 280bp144bp四、青枯菌的寄主范围四、青枯菌的寄主范围 青枯菌的寄主范围非常广泛，可侵染包括54个科的450余种植物，如烟草、番茄、茄子、辣椒、花生、马铃薯、桑树、油橄榄、甘薯等。五、烟草青枯病田间发生动态研讨五、

15、烟草青枯病田间发生动态研讨调查地点：湖北恩施州宣恩县和咸丰县烟田调查地点：湖北恩施州宣恩县和咸丰县烟田调查时间：调查时间：20192019年年6-86-8月月调查方法：采用双行平行腾跃法定点定株调调查方法：采用双行平行腾跃法定点定株调查查调查内容：发病时期，发病率，气候条件等。调查内容：发病时期，发病率，气候条件等。 按照国家规范 (GB/T23222-2019)，以株为单位分级调查，分级规范如下： 0级：全株无病； 1级：茎部偶有褪绿斑； 3级：茎部有黑色条斑，但不超越茎高1/2； 5级：茎基部黑色条斑超越茎高1/2，但未到达茎顶部； 7级：茎部黑色条斑到达茎顶部，或病株叶片全部萎； 9级：

16、病株根本枯死。2019年咸丰点烟草青枯病发生情况年咸丰点烟草青枯病发生情况始发期始发期6月月20日，发日，发病率为病率为3.33%，病情，病情指数为指数为0.37，随着日，随着日平均气温到达平均气温到达25，7月中旬进入盛发期，月中旬进入盛发期，8月底发病率到达月底发病率到达90%以上，病情指数以上，病情指数达达37以上。以上。2019年宣恩点烟草青枯病发生情况年宣恩点烟草青枯病发生情况始发期为始发期为6月月8日，发病日，发病率为率为2.86%，病情指数为，病情指数为0.22，随着日平均气温到，随着日平均气温到达达26，6月下旬烟草青月下旬烟草青枯病进入盛发期，枯病进入盛发期，8月中月中旬发病

17、率到达旬发病率到达93%以上，以上，病情指数到达病情指数到达40以上。以上。 两个地域烟草青枯病始发期都在6月中旬，随着时间的延伸，发病率和病情指数逐渐升高，7月下旬进入盛发期，8月中旬进入稳定期。六、烟草青枯病防治六、烟草青枯病防治1、挑选和利用抗病种类、挑选和利用抗病种类 参试合计参试合计46个烟草种类个烟草种类 苗期温室鉴定：伤根灌菌接种法，接种条件：温度苗期温室鉴定：伤根灌菌接种法，接种条件：温度28 -30 ，RH80%。接种后定期接种后第。接种后定期接种后第5d、7 d、10 d、15d、21d调查发病情况。调查发病情况。大田病圃鉴定：烟株旺长初期，用小铁铲从烟株茎基部斜插大田病圃

18、鉴定：烟株旺长初期，用小铁铲从烟株茎基部斜插人土使侧根受伤，随后浇灌菌液。每隔人土使侧根受伤，随后浇灌菌液。每隔10 d 调查调查1 次发病情次发病情况。况。 接种浓度：接种浓度：1108 CFU/mL。 编号编号品种名称品种名称编号编号品种名称品种名称编号编号品种名称品种名称1人参烟人参烟17蓝玉蓝玉1号号33K42Coker371Gold18G8034Feb-213烤烟烤烟-319RG1135CF2034K32620K39936CF9865云烟云烟8721K326LF37中烟中烟986638822K39438龙江龙江9127K823MCN94439吉烟吉烟9号号8中烟中烟10024Coke

19、r31940LZ39RG1725NC8241翠碧翠碧1号号10CF205（中烟（中烟104）26Coker17642K611中烟中烟10327NC56743云烟云烟9712K34628NC9544南江南江3号号13云烟云烟8529V245毕纳毕纳1号号14FX201930CV8746D10115FY81331CV9116龙江龙江91132K10参参试试烟烟草草种种类类 uu(GB/T 23222-2019) 0级级全株无病全株无病1级级茎部偶有褪绿斑，或病侧茎部偶有褪绿斑，或病侧1/2以下以下叶片凋萎叶片凋萎3级级茎部有黑色条斑，但不超过茎高茎部有黑色条斑，但不超过茎高1/2，或病侧，或病侧1

20、/2至至2/3叶片调萎叶片调萎5级级茎基部黑色条斑超过茎高茎基部黑色条斑超过茎高1/2，但，但未到达莲顶部，或病侧未到达莲顶部，或病侧2/3以上叶以上叶片调萎片调萎7级级茎部黑色条斑到达茎顶部，或病茎部黑色条斑到达茎顶部，或病株叶片全部调萎株叶片全部调萎9级级病株基本枯死病株基本枯死(GB/T 23224-2019) 抗病性抗病性病情指数病情指数高抗（高抗（HR） 0 抗病（抗病（R） 0.120 中抗（中抗（MR） 20.140 中感（中感（MS） 40.160 感病（感病（S） 60.180 高感（高感（HS） 80.1100 苗期鉴定结果苗期鉴定结果苗期鉴定结果：华农温室苗期鉴定结果：华农温室苗期鉴定结果：华农温室苗期鉴定结果：华农温室序号序号抗性评价抗性评价序号序号抗性评价抗性评价序号序号抗性评价抗性评价大田大田