三磷酸腺苷二钠氯化钠注射液的质量控制及安全性研究

1、    三磷酸腺苷二钠氯化钠注射液的质量控制及安全性研究  三磷酸腺苷二钠氯化钠注射液的质量控制及安全性研究   摘要   目的：研究三磷酸腺苷二钠(ATP)氯化钠注射液的质量控制方法及其特殊安全性。方法：结合紫外分光光度法和高效液相色谱法控制ATP氯化钠注射液的质量；过敏性、溶血性及血管刺激性试验评价该制剂的特殊安全性。结果：三批ATP氯化钠注射液有关物质为4.8,含量为102.9；该注射液对受试豚鼠无致敏作用,对家兔红细胞无明显体外溶血和凝聚作用,对家兔耳缘静脉亦无明显刺激性。结论：ATP氯化钠注射液安全、有效

2、、质量可控。   关键词   三磷酸腺苷二钠  紫外分光光度法  高效液相色谱法  溶血作用  刺激性  过敏性 Abstract  Objective:To develop quality control and to study safety evaluation of ATP and sodium chloride injection. Methods:Quality of ATP and sodium chloride injection was analyzed by combining UV

3、and HPLC. Safety evaluation included irritability, hemolysis and stimulation tests. Results:The average total of impurities was 4.8% and the content of ATP was 102.9% in preparation. No hypersensitive action was found on Guinea pig, neither the hemolysis and agglomeration on red cell nor the stimula

4、tion on blood vessel was observed in rabbit. Conlusion: ATP and sodium chloride injection is safe,effective and quality controllable. Key    Words  ATP  UV  HPLC  irritablity  hemolysis  stimulation     三磷酸腺苷二钠(Adenosine Disodium Triphospha

5、te,ATP)广泛存在于人体细胞内,是一种具有多种重要生理活性的辅酶,参与蛋白质、脂肪、糖、磷脂及核酸的合成与代谢,也是体内一切生命活动的主要能量来源。ATP适应于因细胞损伤后细胞酶功能减退引起的疾病,临床上主要用于心律失常、心力衰竭、心肌炎的治疗1,以及脑出血后遗症和肝炎疾病的辅助治疗2，3。目前市场上供注射用的ATP剂型为水针和粉针,海南新隆药业有限公司联合江西科伦药业有限公司解决了ATP不稳定的工艺难题4,首次研究申报了大容量氯化钠注射液,减少了药物配液交叉污染的机会,提高了该药的临床应用水平。本文对ATP氯化钠注射液质量可控性和制剂安全性进行了探讨。   1  试验

6、材料    高效液相色谱仪(SPD-10A检测器,LC-10AT泵,日本岛津公司),PHs-25酸度计。ATP对照品(含量>99.5%)；ATP氯化钠注射液(规格：100mL:20mg,批号：050601、050602、050603,江西科伦药业有限公司),甲醇(色谱纯),其他试剂(分析纯)。 豚鼠,雄性,体重250350g；家兔,雌雄不限,体重2.02.5Kg,中国医科大学第二临床学院实验动物中心提供。   2  方法与结果  2.1  质量控制 2.1.1  总核苷酸测定  精密量取本品5mL,

7、置50 mL量瓶中,加0.1mol·L1磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钠35.8g,加水至1000mL,无水磷酸二氢钾13.6g,加水至1000mL,互调pH值至7.0)至刻度,振摇使混匀,以上述缓冲液为空白溶液,照分光光度法测定,在259nm的波长处测定吸收度,按ATP的百分吸收系数为279计算总核苷酸。 2.1.2  ATP的重量比  KromasilC18色谱柱(250mm×46mm,5m),流动相0.2mol·L1磷酸盐缓冲液(磷酸氢二钠35.8g,磷酸二氢钾13.6g,加水900mL溶解,用氢氧化钠溶液调节pH为7.0,加入四丁基溴化铵1.

8、61g,加水至1000mL)-甲醇(95:5),柱温35,流速为1.0mL·min1,检测波长为259nm,理论板数按ATP峰计算应大于2000,各色谱峰的分离度应大于1.5。按出峰次序依次记录一磷酸腺苷,二磷酸腺苷和三磷酸腺苷的峰面积,HPLC分析见图1。参照中国药典5计算ATP的重量比。HJ ATP含量(%)总核苷酸×ATP的重量比(%)标示量。 有关物质(%)1-ATP的重量比(%)。 A. ATP对照品  B. ATP氯化钠注射液 a.一磷酸腺苷 b.二磷酸腺苷 c.三磷酸腺苷 2.1.3  标准曲线  紫外分光光度法：精密称取ATP对

9、照品20mg,置100mL量瓶中,加水溶解并稀释至刻度。精密吸取0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL分别至10mL量瓶中,加0.1mol·L1磷酸盐缓冲液稀释至刻度,照分光光度法测定。结果表明,在1228g·mL1的范围内,浓度与吸收度具有良好的线性关系,Y =0.0322 X -0.0335,R0.9994。高效液相色谱法：精密称取ATP对照品20mg,置10mL量瓶中,加水溶解并稀释至刻度。精密吸取0.2mL、0.6mL、1.0mL、1.4mL、1.8mL分别至10mL量瓶中,加水稀释至刻度。分别取20l注入液相色谱仪,记录色谱图。结果表明,在0.

10、040.36mg·mL1的范围内,浓度与峰面积具有良好的线性关系,Y=2×107X+2×104,R0.9996。 2.1.4  回收率试验  精密称取16、20和24mg的ATP对照品各三份,分别加入处方量辅料,置100mL量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液。测定总核苷酸和ATP的重量比,计算回收率(n=3)分别为99.1、100.8和99.3。 2.1.5  精密度和稳定性试验  取同一份ATP氯化钠注射液测定6次,测定总核苷酸和ATP重量比,计算含量和RSD%分别为102.8和0.85。于0、2、4、6、

11、8和12小时测定同一份样品,结果在样品在12小时稳定。 2.1.6  重复性试验  取ATP氯化钠注射液6份,测定总核苷酸和ATP重量比,计算含量和RSD%分别为102.8和1.15。 2.1.7  含量测定和有关物质  取本品3批样品,测定总核苷酸和ATP重量比,计算有关物质和标示含量结果见下表。      表1  ATP氯化钠注射液有关物质和含量测定(n=3)   批 号     有关物质(%)  标示含量(%) 050601 &#

12、160;    4.7        102.7 050602    4.6        102.9 050603      5.1        103.0 平均值    4.8        1

13、02.9   2.2  安全性试验 2.2.1  过敏性试验  取健康豚鼠18只,体重250350g,随机平均分成3组,分别为生理盐水组、阳性对照组和ATP氯化钠注射液组,隔日腹腔注射各组受试药物0.5mL只,共3次。首次注射后的第14天和第21天,各组分别取3只豚鼠,分别给予对应的受试药物1.0mL只进行攻击,观察过敏反应现象。阳性对照组豚鼠在注射后共有5只出现呼吸困难、喷嚏、干呕、咳嗽等过敏反应,给药组及阴性对照组两次攻击后均未见异常表现,结果均为阴性。 2.2.2  体外溶血试验  取兔血,离心、洗涤后,制备体积分数为

14、2%的红细胞混悬液。取试管7支,分别加入2.5mL红细胞混悬液,其中两支分别加入2.5 mL蒸馏水和生理盐水,作为阳性对照和阴性对照,其他5只试管中依次加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL ATP氯化钠注射液,各试管分别补加生理盐水至5mL,摇匀,置37水浴保温,连续观察4h。阳性对照管加入蒸馏水后,立即出现溶血现象；各供试药液管及阴性对照管未发生溶血现象,红细胞逐渐沉于管底,经振摇后可均匀散开,说明亦无红细胞凝聚现象。 2.2.3  血管刺激性试验  家兔8只,分2组,每组4只,分别于耳缘静脉滴注ATP氯化钠注射液和0.9氯化钠注射液,滴注量均为4mL

15、3;kg1,滴速为1.0mL·min1,每天1次,连续3d,给药期间每日观察血管注射部位及整个外耳廓有无变化。在第三次给药后24h将动物处死,取给药处血管及周边组织,以5%甲醛溶液固定、切片、染色,切片部位为进针部位向心端1cm及2cm处。给药组、生理盐水注射液对照组血管均未见异常病理改变,耳缘静脉内无血栓形成,血管内皮细胞及周围组织未见水肿、炎性浸润或坏死等异常改变。   3  讨论    含量和有关物质是衡量药物有效性和内在品质最重要的指标,一般来说,越接近标示含量,有关物质越少,则药物的品质越高。ATP化学结构不稳定,高温和长期

16、存放时容易分解成ADP和AMP,这两种物质不具有毒副作用,体内与ATP存在相互转化关系。但是,药品注册管理办法规定有关物质作为药品质量控制的指标,必须规定限度。中国药典标准和部颁生化药品标准对ATP原料和制剂有关物质未作要求,仅对原料含量要求分别为大于95和85。测定了上市多个厂家的ATP水针制剂,有关物质均在10左右,ATP氯化钠注射液采用精制高纯度原料,含量高,制剂有关物质低,确保了临床应用的有效性。   本文提供的质量控制方法,能够控制ATP氯化钠注射液的质量。按照中国药典2005版二部注射剂项下有关要求,质量标准还增加鉴别、细菌内毒素和氯化钠含量测定等项目,确保药品的安全有效。特殊安全性试验表明,ATP氯化钠注射液对受试豚鼠无致敏作用,对家兔红细胞无明显体外溶血和凝聚作用,对家兔耳缘静脉亦无明显刺激性,符合临床安全性方面的要求。由此可见,ATP氯化钠注射液安全、有效、质量可控。 参考文献