DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染方法的探讨_李其松

1、黑龙江畜牧兽医2006年第10期79DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染方法的探讨李其松,王金玉,沈 华,戴国俊,杨风萍,陈义权,焦彩兰(扬州大学动物科学与技术学院,江苏扬州225009)中图分类号:S813文献标识码:B文章编号:10047034(2006)1000790210%乙醇及0.5%冰乙酸固定10min;(2)用纯化水漂洗;(3)用0.1%硝酸银染色20min;(4)用纯化水漂洗;(5)用1.5%、0.5%甲醛显色。2 结果具体结果见图15。图1、图2为不同交联度下的电泳图谱,图3、图4、图5为不同胶浓度下的电泳图谱。* 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是聚合酶链反应、单链构象多态(PCR

2、-SSCP)分析中不可缺少的技术,多用于单链DNA碱基移位、插入或缺失等基因变异情况的筛查,还可以广泛用于遗传育种、基因定位、种子活力测定等方面。银染方法的建立,始于1979年对蛋白质的染色,以后逐渐应用于核酸。对蛋白质与核酸的检测灵敏度可达到纳克水平,促进了生物大分子结构与功能的研究。电泳完毕后,首先用固定剂将核酸或蛋白固定到凝胶上,然后使银染剂中的银离子与之牢固结合,再通过还原剂将银离子还原,从而发生银棕色显色反应。1 材料和方法1.1 材料垂直板电泳系统,PCR扩增产物;其他生化试剂均为分析纯。1.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳1.2.1 非变性PAGE的制备 分别在足够灌胶体积的凝胶混合液中加

3、入不同体积的丙烯酰胺贮备液及相应的DDH2O配制成8%、10%、12%、14%浓度的凝胶混合液,并加入甲叉双丙烯酰胺(TEMED)30 L,终浓度为1 的过硫酸胺,终浓度为1 TBE(由10 8gtris、5.5g硼酸、0.7444gEDTA溶于1000mLd-dH2O配成的混合液)及相应的DDH2O,充分混匀并灌胶。表1 丙烯酰胺贮备液的制备丙烯酰胺贮备液/%3020丙烯酰胺 N,N -亚甲双丙烯酰胺29 119 1图1 交联度为39 1的胶图2 交联度为19 1的胶1.2.2 样品制备 利用不同PCR-SSCP产物作为样品试剂(上样缓冲液为40%蔗糖水溶液,含0.025%溴酚蓝,0.025

4、%二甲苯青)。1.2.3 电泳 上下槽加1 TBE,上样,室温,150V恒压,电泳至指示染料二甲苯青泳出胶板。1.3 银染方法染色方法采用改进的硝酸银染色方法:(1)用收稿日期:20050919作者简介:李其松(1981),男,硕士研究生.图3 14%的胶图4 10%的胶 图5 8%的胶803 讨论传统的核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳需根据所分离的DNA片段长度配制不同浓度的凝胶,一般在3.5%20.0%,此试验主要结合其他试验,重在摸索最佳的聚丙烯酰胺凝胶电泳的条件,以检测PCR产物或者DNA。从试验结果可知,不同的聚丙烯酰胺凝胶交联度对相同的PCR产物进行电泳时会产生不同的结果。在其他条件都相同时

5、高交联度(丙烯酰胺 N,N -亚甲双丙烯酰胺为39 1)的聚丙烯酰胺凝胶电泳条带清晰,没有多余的细小条带,在低交联度(丙烯酰胺 N,N -亚甲双丙烯酰胺为19 1)的聚丙烯酰胺凝胶可能出现与PCR产物中与目的条带相近的细小条带(俗称影子带),若对目的条带不是很了解,则不利于基因型的判断。在其他条件相同时,不同的聚丙烯酰胺凝胶浓度对相同的PCR产物进行电泳时也会产生不同的结果,条带相近的PCR产物在高浓度的聚丙烯酰胺凝胶电泳中条带更易压缩,更易分开,而在低浓度的聚丙烯酰胺凝胶电泳中占的体积大,条带较弥散,不易分开,不利于基因型的判断。在低浓度中同一电泳道中的多个条带之间的绝对距离较高浓度的绝对距

6、离HeilongjiangAnimalScience andVeterinaryMedicine102006要远,同样有利于基因型的判断。目前,许多实验室PCR扩增的片段主要采用琼脂糖电泳、EB染色。在琼脂糖中用EB染色可检测出少于10ng的DNA,但琼脂糖电泳的分辨率较低,对有些试验不太适用。聚丙烯酰胺的分离效果较好,但如果用EB染色,聚丙烯酰胺淬灭EB的荧光,使EB染色的灵敏度降低,不能检测出少于10ng的DNA。另外,EB染色容易产生污染。用EB染色后,只能用照片记录试验结果,而不能把试验结果及时保存下来为以后的试验做参考和指导。试验采取了银染的方法,同时在试验中我们将染色的方法作了改进

7、。这种方法可提高灵敏度510倍,而且避免了EB的污染及紫外光对人眼睛和皮肤的损伤,并缩短了银染的时间。同时改进的染色方法与其他方法相比具有操作时间短、背景颜色浅、操作程序简单、灵敏度高、染色液容易保存等优点。高浓度、高交联度的凝胶中不同的DNA分子条带更易分开,条带清晰,利于判型;低浓度、低交联度的凝胶中,同一电泳道中的多个条带之间的绝对距离更远,同样利于不同基因型的判断,每位试验者应该根据自己的试验适时调整试验方法,同时选择简单方便的染色方法,可以收到事半功倍的效果。(009)犬自体皮肤嵌植移植技术刘学龙,徐文龙,刘运龙,张明华,赵 鹏(延边大学农学院,吉林龙井133400)中图分类号:S8

8、58 292文献标识码:B文章编号:10047034(2006)10008002嵌植移植技术已经广泛的应用于人医方面,但因其手术操作要求比较严格,过程比较精细和复杂,尤其是术后护理比较困难,在兽医临床上还难见应用,特别是在我国更是罕见。目前,牛马的自体移植技术已经得到了一定的研究和应用,而嵌植移植技术在犬的应用还是一片空白。此次试验采用一种小块皮片的嵌植移植技术,在犬身上进行自体皮肤移植,取得了满意的结果。此次试验证明,应用同体薄层小块皮片嵌植移植手术方法,皮肤移植成功率可高达85%,同体薄层小块皮片嵌植移植手术是治疗皮肤缺损的一种有效治疗手段,具有显著的兽医临床使用价值。1 试验材料和方法1.1 材料试验动物:雌性犬1只,体重15kg。收稿日期:20050805试验药品:生理盐水、青霉素、消炎粉、云南白药、眠乃宁、苏醒灵、1%新洁尔灭、5%碘酊、止血敏、75%酒精。试验器械:手术刀、剃须刀片、组织剪、剪毛剪、镊子、刻度尺、搪瓷盘、口套、铁链、平板、复绷带、小动物多功能手术台及其常规器械(创巾、巾钳、止血钳、纱布、绷带、胶带)。1.2 方法1.2.1 药品制备 将2瓶160万IU的青霉素溶于500mL生理盐水中,摇匀,备