磷霉素与14种抗菌药物分别联用的体外抗菌活性研究

1、磷霉素与14种抗菌药物分别联用的体外抗菌活性研究中国抗生素杂志2005年4月第3O卷第4期?233?文章编号:10018689(2005)04023305磷霉素与14种抗菌药物分别联用的体外抗菌活性研究佟金平王镇山薛欣顾俊明(1大连大学附属医院,大连1160212大连医科大学附属第二医院,大连116023)摘要:目的研究磷霉素与14种常用抗菌药物分别联用在体外抗耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)过程中的相互作用关系,为临床联合用药提供实验依据.方法将磷霉素等15种抗菌药物单独以及磷霉素与14种抗菌药物分别联用作用于163株MRS菌株,通过测定最低抑菌浓度(MIC),计算部分抑菌浓度(FIC)指数,测

2、定不同作用时间的细菌菌落数,绘制杀菌曲线,扫描电镜观察细菌形态学改变,以评价磷霉素和这些抗菌药物联合应用的体外相互作用关系.结果磷霉素与头孢唑林,头孢呋辛,头孢噻肟,头孢哌酮,头孢甲肟,氧氟沙星,环丙沙星,左氧氟沙星,加替沙星,红霉素,罗红霉素,克拉霉素,庆大霉素,阿米卡星在体外分别联合应用后,MIC值均比单独应用时下降,FIC指数均2;联合应用可增强杀菌活性.扫描电镜观察,1/4MIC浓度的阿米卡星或氧氟沙星单独作用于MRS菌时,细菌形态学无改变,1/4MIC浓度的磷霉素单独应用时细菌肿胀,变形,同样浓度两药联用后,细菌发生变形和破坏,细菌数量明显减少.结论磷霉素与14种抗菌药物分别联用对M

3、RS具有协同抗菌作用,尤其能够提高头孢唑林,阿米卡星,氧氟沙星对MRS的杀菌速度.关键词:磷霉素;耐甲氧西林葡萄球菌(MRS);体外抗菌活性;相互作用中图分类号:R965文献标识码:AInvitroantibacterialactivityoffosfomycinincombinationwith14antimicrobialagentsTongJinping,WangZhenshan,XueXinandGuJunming.(1TheHospitalAffiliatedtODalianUniversity,Dallan116021;2TheSecondAffiliatedHospitalofD

4、alianUniversityofMedicalSciences,Dalian116023)ABSTRACT0bjectiveTostudytheinvitrointeractionsoffosfomycincombinedwithother14commonlyusedantibacterialagentsintheirbactericidalprocessesagainstmethicillinresistantStaphylococcus(MRS),andprovideexperimentalevidenceforclinicalcombinationapplication.Methods

5、OnehundredandsixtythreestrainsofMRSweretreatedby15antibacterialagentsincludingfosfomycinanditScombinationswithcefazolin,cefuroxime,cefotaxime,cefoperazone,cefmenoxime,ofloxacin,levofloxacin,gatifloxacin,ciprofloxacin,erythromycin,roxithromycin,clarithromycin,gentamicinandamikacin.Invitt0antibacteria

6、lactivityandinteractionwereevaluatedbytestingminimalinhibitoryconcentration(MIC),calculatingthefractionalinhibitoryconcentration(FIC)index,countingthecolonyformingunits,drawingthetimekillingcurveandobservingthemorphologicalchangeofbacteria.ResultsTheinvitroantibacterialactivityof15antibacterialsincl

7、udingfosfomycinanditscombinationswithother14agentswereinvestigated.MICsofcombinationswerelowerthanthoseof14drugstestedaloneandFICindex2.Theantimicrobialactivitiesofcombinationwereincreased.Scanningelectronmicroscopyshowedthat1/4MICoffosfomycincombinedwith1/4MICoramikacinor1/4MICofloxacin(substancest

8、hatdonotcausemorphologicalalterationswhengivenalone)resulteddistortionandthenumberdecreasing.ConclusionSynergisticantibacterialeffectswasobservedinfosfomycinincombinationwith14antibacterialsagainstMRS.KEYWORDSFosfomycin;MethicillinresistantStaphlOcOccus;Invitroantibacterialactivity;Interaction收稿日期:2

9、004-0706修回日期:2004一l217作者简介:佟金平.女,生于l969年.硕士,主治医师.?234?磷霉素与14种抗菌药物分别联用的体外抗菌活性研究佟金平等随着新型抗菌药物的不断开发和临床应用,细菌耐药日益突出,尤其是院内耐甲氧西林葡萄球菌(methicillinresistantstaphylococcus,MRS)的感染日益受到重视,MRS感染的治疗问题也成为临床棘手问题.在现有药品中探索高效,低毒的联合用药方案成为研究热点.磷霉素具有独特的化学结构,与其它抗菌药物一般不产生交叉耐药性.国外有学者报道磷霉素与其它抗菌药物联合在体外具有协同抗菌效应】,国内此方面研究很少.本文旨在研究

10、磷霉素与14种抗菌药物分别联用对临床分离的MRS菌株的体外抗菌活性,为临床联合用药提供实验依据.1材料与方法1.1材料1.1.1菌株收集自2002年1月至2004年1月大连医科大学附属第二医院和大连市中心医院的临床标本,经APIStaph系统试条鉴定,凝固酶初筛,按NCCIS332002年标准,琼脂二倍稀释法检测为MRS菌株(MRSAMIC4gg/ml,MRCNSMIC0.5gg/m1)163株.标准参考菌株ATCC25923及ATCC25922由中国药品生物制品检定所提供.1.1.2培养基MH琼脂及肉汤为杭州天和微生物试剂有限公司产品,批号分别为20030507与20030827.1.1.3

11、抗菌药物磷霉素(fosfomycin,FOM)由东北制药总厂生产,效价75.76,批号20030201;头孢唑林(cefazolin,CEZ)由哈药集团制药总厂生产,每支0.5g,批号B03067018;阿米卡星(amikacin,AMK)为上海禾丰制药有限公司产品,每支0.2g,批号20030916;克拉霉素(clarithromycin,CI)由辉瑞制药公司提供,每支300mg,批号20030901;头孢呋辛(cefuroxime,CXM,效价92),头孢噻肟(cefolaxime,CTX,效价9O.6),头孢哌酮(cefoperazone,CPZ,效价94.4),头孢甲肟(cefmeno

12、xime,CMX,效价87),氧氟沙星(ofloxacin,OFIX,效价99.9),左氧氟沙星(1evofloxacin,IVIX,效价99.5),加替沙星(gatifloxacin,GTIX,效价98),环丙沙星(ciprofloxacin,CP1X,效价84.2),红霉素(erythromycin,EM,效价88.5%),罗红霉素(roxithromycin,RO,效价95.2),庆大霉素(gentamicin,GM,效价63.1)为中国药品生物制品检定所产品.1.2方法1.2.1联合抑菌试验(1)琼脂二倍稀释法测定15种药物的最低抑菌浓度(MIC).(2)按1:1的浓度比例,琼脂二倍稀

13、释法测定磷霉素与14种药物分别联用的MIC.(3)计算部分抑菌浓度(FIC)指数.FIC指数一A药联合时的MIC/A药单尉时的MIC+B药联合时的MIC/B药单用时的MIC判定标准FIC指数<O.5为协同作用;0.51为相加作用;12为无关作用;>2为拈抗作用.1.2.2时间一杀菌曲线(1)琼脂二倍稀释法测定拟实验药物单药的MIC.(2)无菌试管分别加入终浓度为2MIC,1/4MIC浓度的单药及1/4MIC浓度的两药联合的抗菌药液,并设立生长对照管.(3)每管中加入0.1ml稀释后的菌液,加入MH肉汤至10ml,细菌终浓度为1OCFU/ml.(4)分别于0,2,4,

14、6,8,24h将试管摇匀后取出50gl,稀释后涂布于MH琼脂平板上,孵育过夜后计数菌落数.(5)根据各时问点计数的菌落数的对数值在坐标纸上绘制杀菌曲线图.1.2.3电镜扫描技术将孵育过夜(18h)的含有1MIC浓度的磷霉素(128gg/m1),1/4MIC浓度的磷霉素(32gg/m1)及联合用药(2药均为1/4MIC浓度)的MH肉汤低转速离心,弃去上清液,用2.5的戊二醛固定,再次离心,沉淀物经0.1PBS缓冲液清洗3次后,锇酸固定1h,再用0.1PBS缓冲液清洗3次,然后用叔丁醇脱水干燥,粘台,镀膜后用Jem一1200ex型扫描电镜观察细菌形态变化.2结果2.1联合抑菌实验结果2.1.1磷霉

15、素等15种抗菌药物单独应用对163株MRS的体外活性表1提示,磷霉素,头孢唑林:头孢呋辛,头孢噻肟,头孢哌酮,头孢甲肟,红霉素,罗红霉素,克拉霉素,阿米卡星,庆大霉素,环丙沙星,左氧氟沙星对MRS的MIC.均显示耐药,氧氟沙星,加替沙星对MRS的MIC.显示中介.2.1.2磷霉素与14种抗菌药物分别联合应用对163株MRS的体外抗菌活性磷霉素与14种抗菌药物分别按1:1联合对163株MRS的MIC.值均有所下降,除加替沙星MIC.值下降至原值的1/2外,其余均降至原值的1/4以下(表2).磷霉素与14种抗菌药物分别按1:1联用后协同/相加作用大于无关作用的比例见表3,未见拮抗作用.中国抗生素杂

16、志2005年4月第3O卷第4期?235?表1磷霉素等15种抗菌药物对163株MRS的体外抗菌活性(g/m1)表2磷霉素与14种抗菌药物联合应用对163株MRS的体外抗菌活性(g/m1)药物联合比例为l:l.表3磷霉素与14种抗菌药物分别联用的体外相互作用所占比例*药物联合比例为l:l.2.2杀菌曲线当磷霉素浓度高于MIC(16pg/m1)时,增加磷霉素浓度,对ATCC25923的杀菌曲线无明显变化.2号菌株实验当1/4MIC浓度的磷霉素(16g/m1)与1/4MIC浓度的头孢唑林(16g/m1)联合应用时,杀菌作用较2MIC浓度的头孢唑林(128,ug/m1)及2MIC浓度的磷霉素(128g/

17、m1)强;1/4MIC浓度的磷霉素(16pg/m1)与1/4MIC浓度的头孢呋辛(32g/m1)联合后,杀菌作用与2MIC浓度的头孢呋辛(256gg/m1)相似,强于2MIC浓度的磷霉素(128g/m1).166号菌株实验当1/4MIC浓度的磷霉素(32gg/m1)与1/4MIC浓度的头孢噻肟(32gg/m1)联合后,杀菌作用与2MIC浓度的头孢噻肟(256gg/m1)或2MIC浓度的磷霉素(256g/m1)相似;1/4MIC浓度的阿米卡星(16gg/m1)与1/4MIC浓度的磷霉素(32g/m1)联合后,4h即杀灭细菌,后未再生长,远远强于2MIC浓度的磷霉素(256g/m1)和2MIC浓度

18、的阿米卡星(128gg/m1);1/4MIC浓度的氧氟沙星(4g/m1)和1/4MIC浓度的磷霉素(32g/m1)联合后6h杀灭细菌,后未再生长,远远强于2MIC浓度的磷霉素(256g/m1)和2MIC浓度的氧氟沙星(32g/m1).图1为磷霉素与阿米卡星联合的杀菌曲线.2.3电镜观察,-应用扫描电镜技术观察磷霉素与阿米卡星,氧氟沙星分别联合时的细菌形态学变化.我们看到,1M1C浓度的磷霉素(128g/m1)单独作用于细菌时,细菌破坏,内容物暴露;1/4MIC浓度的磷霉素(32g/m1)单独作用于细菌时,细菌肿胀,变形,但无细菌破坏.l/4MIC浓度的阿米卡星(16g/m1)单独应用时细菌细胞

19、完整(图2左),但当1/4MIC浓度的磷霉素02468244fUj(h)l:对照;2:FOM32/Jg/ml;3:FOM256/Jg/ml;4:AMKl6/Jg/ml;5:AMKl28/Jg/ml:6:FOM32g/ml十AMY,16g/ml图1磷霉素与阿米卡星联合对166号菌株的杀菌曲线?236?醉霉索与l4种抗菌药物丹别联用的体外抗菌恬性研究佟金平等(32.g/m1)与1/4MIC浓度的阿米卡星(16g/m)联合应用时,细菌出现了明显的破坏,细胞壁不完整,细菌的数量也明显减少(图2右).同样,当l/4MIC浓度的氧氟沙星(4tg/m1)单独应用时细菌细胞完整(图3左);1/4M1C浓度的磷

20、霉素(32g/m1)与1/,IMIC浓度的氧氟沙星(4ug/m1)联台应用时,细菌出现了明显的破坏,细菌的数量也明显减少(图3右).3讨论磷霉素属于细菌繁殖期快速杀菌剂,抗菌谱广.对革兰阳性球菌及革兰阴性杆菌均有杀灭作用:分子量小.易吸收,容易在细菌体内形成高浓度;磷霉素具有独特的化学结构,与其它抗苗药物一般不产生交叉耐药性.有报道联合用药可取得满意的临床疗效,目前国内缺乏相应的实验依据,本研究就磷霉素与临床常用抗菌药物的体外联合抗菌活性进行了初步探讨.本文研究了磷霉索等15种抗菌药物对MRS菌株的抗菌恬性,琼脂二倍稀释法测定结果表明MRS对所有的内酰胺类,大环内酯类,氨基糖苷类抗茁药物均耐药

21、.其MIC.均大于NCCIS制定的耐药标准t呈现多重耐药性,这与文献报道一致.对少数氟喹诺酮类呈现中介,对磷霉索耐药,这与文献报道不完全一致磷霉索本身虽然对MRS的MIC值较高,但磷霉索与本实验中的14种抗菌药物分别联合应用后,对MRS均有协同或相加作用,增强了后者的抗菌活性,尤其是磷霉素与头孢唑林,头孢呋辛,头孢噻肟,阿米卡星联合后,使后者由耐药变成敏感.磷霉素属于杀菌剂,本实验时间杀菌曲线提示磷霉素为非浓度依赖性药物.增大磷霉素浓度(>MIC时)并不能使杀菌速度明显增快,与内酰胺类抗生素相似,提示在临床抗感染治疗中磷霉索应小剂量分次给药,这种用药方案既保证了血浆中有效血药浓度

22、又减少了不良反应.由时问杀菌曲线分析.磷霉索低浓度时本身虽无明显杀菌作用,但增强了其它抗菌药物的抗菌活性,使其它抗菌药物的杀菌速度明显增快,以头孢唑林,阿米卡星,氧氟沙星为明显,可能与这几种药物自身对葡萄球菌的抗菌活性较强有关.正常葡萄球菌产生5种青霉素结合蚤白(PEP):PBPL,PBP1,PBPu,PBP和PBP.,而MRS则产生一种新的PBP,即PBP:.PBP与内酰胺类抗生素亲和力极低,很少或不被内酰胺类抗生素结合,当其他PBP活性被抑制时,PBP起到合成细胞壁的作用,从而对p内酰胺类抗生素产生耐药”】.Usui等应左图为阿米卡星浓度为161g/ml;右圈为阿米卡望(1filg/m1)

23、与磷霉豢(32Pgm【)联台图2阿米卡星单独以及与磷霉素联台作用于MRS(】66号菌株)的形态学改变左同:氧氟抄星澉度为g!ml;右圈氧氟抄星l4lJg/ml】与酶霉素(32Iiml】联台图3氧氟沙星单独以及与磷霉素联台作用于MRS(166号菌株)的形态学改变中国抗生素杂志2005年4月第3O卷第4期?237?用HC标记法测定PBP.,显示应用磷霉素后可使PBP抽明显减少,说明磷霉素能够与PBPz结合,且增强了p一内酰胺类抗生素的抗菌活性.磷霉素作用于细菌细胞壁合成的第一步,因其化学结构与细菌细胞壁粘肽合成初期的烯醇式丙酮酸转移酶(EP转移酶)的底物磷酸烯醇丙酮酸(PEP)相似,竞争性抑制使该

24、转移酶失活,从而抑制细菌细胞壁的早期合成,破坏其完整性,有利于其它抗菌药物进入细菌体内5.扫描电镜观察结果提示,低于MIC浓度的磷霉素使细菌肿胀变形,推测细菌细胞壁通透性增加,增加了其它抗菌药物进入细菌体内的量,获得协同或相加的抗菌疗效.本研究发现,阿米卡星与氧氟沙星等虽然对细菌细胞壁无影响,当与磷霉素联合后则细菌破坏,这与文献报道一致1”“.说明磷霉素与这类抗菌药物联合应用可增强这类抗菌药物的抗菌活性.有报道Ll磷霉素能够破坏生物被膜或抑制其形成,因此,磷霉素可以联合其它抗菌药物治疗生物被膜病.另外,磷霉素与环丙沙星1联合应用抗生素后效应(PAE)呈相加作用,提示磷霉素与环丙沙星临床联合应用

25、时可以减少药物的单剂量,延长用药间隔.综上所述,磷霉素本身抗菌活性虽然不强,但若合理地与其它抗菌药物(如内酰胺类,氨基糖苷类,氟喹诺酮类,大环内酯类)联合使用可取得良好的体外抗菌效果,尤其能够提高头孢唑林,阿米卡星,氧氟沙星对MRS的杀菌速度.今后需进一步进行动物实验和临床疗效观察.参考文献1GrifK,ManfredPD,PfallerK,eta1.Invitroactivityoffosfomycinincombinationwithvariousantistaphy1occa1substancesJ.JAntimicrobChemother.2001,48:20923UtsuiY,Ohy

26、aS,MagaribuchiT,eta1.Antibacterialactivityofcefmetazolealoneandincombinationwithfosfomycinagainstmethicillin?andcephem?resistantStaphy.1ococcusaurelg$J.AntimicrobAgentsChemother,1986,30(6):9173NCCLS.PerformanceStandardsforantimicrobialsusceptibilitytestings.2002,vo1.22No.1M100一S12M2一A7andM7一A54倪语星,洪

27、秀华.联合药物敏感试验和体外杀菌试验A.细菌耐药性监测与抗感染治疗M.北京:人民军医出版社,2002:4,835殷凯生,殷民生.实用抗感染药物手册M.北京:人民卫生出版社,2001:2016NabinK,ShresthaJ,TomfordW.Fosfomycin:AreviewJ.InfectDisClinPrac,2001,1O(5):2557马越,姚蕾,陈鸿波,等.临床常见细菌的耐药性问题J.中国抗生素杂志,2002,27(3):1298李胜利,张婴元,周乐,等.24种抗菌药对临床分离葡萄球菌的体外抗菌活性J.中国抗感染化疗杂志,2001,1(2):759DelVO,TrincadoP,MartinMT,eta1.TheprevalenceofmethicillinresistantStaph3lococcusaureusphagotype95intheHospitalsvaildHebronofBarcelonaJ.EnfermInfeccMicrobiolClin,1999,17(10):4981OYos