参麦注射液对大鼠神经元内质网应激诱导凋亡的影响

1、参麦注射液对大鼠神经元内质网应激诱导凋亡的影响 10-09-08 15:54:00 编辑：studa20 作者：李晓峰 张红 董艳玲 王铁建 李燕华 李吕力【摘要】 目的 探讨参麦注射液对大鼠皮层神经元内质网应激诱导凋亡的保护作用。方法 体外培养SD乳鼠皮层神经元细胞，免疫组织化学、免疫荧光染色鉴定神经元纯度，流式细胞术Annexin、PI双标检测凋亡率及活性caspase3、9表达，Western印迹免疫分析GRP78、细胞色素C蛋白、Bcl2蛋白表达，Fura2/AM法荧光分光光度计检测细胞内钙浓度（Ca2+i）。结果 SD乳鼠皮层神经元可纯化体外培养,2 mol/L毒胡萝卜素作用神经元2

2、4、48 h细胞凋亡率分别是17.88%、21.38%，参麦治疗组分别是7.42%、8.16%，两组差异显著(P0.05)。胡萝卜素诱导神经元糖调节蛋白GRP78表达上调，活化caspase3、9，使细胞色素C蛋白表达增加，Bcl2表达减少。参麦注射液促进细胞Bcl2表达，抑制细胞色素C释放，减少活性caspase3、9含量，降低Ca2+i浓度。结论 参麦注射液能抑制体外培养神经元内质网应激所致的凋亡可能与其降低Ca2+i浓度有关。 【关键词】 细胞凋亡；内质网应激；caspase；Bcl2；参麦注射液 【Abstract】 Objective To observe the protect e

3、ffects of Shenmai (SM) injection on endoplasmic reticulum stressinducing rat cortical neuronal apoptosis. Methods Primary cortial neurons were cultured in vitro and NSEpositive cells were detected by immunofluorescence staining and immunohistochemistry. The percentage of apoptotic cells and protein

4、expression of caspase3,9 were determined by flow cytometric analysis. Protein levels of GRP78, cytochrome C, Bcl2 were assessed by immunoblotting. Intracellular free calcium concertration Ca2+i was measured with fluorophotometry. Results Cortical neurons of neonate rats could be cultured in vitro, t

5、he percentage of apoptosis induced by thapsigargin after intervened for 24 and 48 h was 17.88% and 21.38% respectively. GRP78 and cytochrome C protein levels were elevated in cortical neurons in response to thapsigargin. The expression of caspase3 and 9 were activated and the protein level of Bcl2 w

6、as decreased. SM significantly decreased the percentage of neuronal apoptosis and increased the expression of Bcl2, reduced neuronal Ca2+i and the expression of caspase3 and 9, inhibited the leakage of cytochrome C.Conclusions SM has effect of antineuronal apoptosis induced by endoplasmic reticulum

7、stress in vitro, which might be related to decreasing intracellular free calcium concentration. 【Key words】 Apoptosis；Endoplasmic reticulum stress；Caspase；Bcl2；Shenmai injection凋亡是脑缺血后神经元死亡的一种重要形式。凋亡信号途径包括外源性、内源性/应激途径。缺血后神经元的凋亡发生是一个多环节调控过程，其中包括基因表达的改变、兴奋性氨基酸的释放、钙离子稳态失衡、热休克蛋白表达受阻、脂肪酸与自由基形成、蛋白酶激活等过程，但

8、脑缺血后神经元凋亡发生的确切机制目前还不十分清楚。内质网可能是细胞内诱导凋亡的一个新场所，内质网在应激状态下，可迅速诱导凋亡。毒胡萝卜素(thapsigargin)为不可逆性内质网钙ATP酶抑制剂，可诱导内质网应激。本研究旨在探讨大鼠皮层神经元内质网应激诱导细胞凋亡机制以及参麦注射液的保护作用。1 材料与方法1.1 动物与试剂新生SD大鼠（出生24 h内）由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（鄂）20040007。高糖DMEM、神经元基础培养液、B27、胎牛血清、马血清购自GibcoBRL公司；胰蛋白酶、L多聚赖氨酸购自Sigma公司；Annexin VFTTC购自

9、Bender MedSystems公司；Fura2/AM购自晶美生物公司；活性caspase3、caspase9试剂盒购自BioVision公司；AntiGRP78多克隆抗体购自Stressgen公司；Bcl2、细胞色素C试剂盒购自Santa Cruz公司；神经元特异性烯醇化酶(NSE)组化试剂盒购自北京中山公司；其他均为市售分析纯。参麦注射液由人参、麦冬组成，每支10 ml,含生药0.5 g，批号为0807046，正大青春宝药业有限公司出产。1.2 仪器CO2恒温细胞培养箱(Napco 5410220，美国)；荧光倒置显微镜(Olympus日本)；全自动酶标分析仪 （Thermo elect

10、ron corporation Multiskan MK3,美国）；流式细胞仪(FACSCLSR，BectonDickton，美国)；F2000型双波长荧光分光光度计(Hitachi 850，日本)。1.3 分组与给药实验分为阴性对照组 (正常培养神经元)，毒胡萝卜素组(神经元基础培养液中加2%B27，加2 mol/L毒胡萝卜素2448 h)，参麦治疗组(神经元基础培养液中加2% B27，2 mol/L毒胡萝卜素，参麦注射液10 ml/L 2448 h)。1.4 皮层神经元培养取出生24 h以内SD大鼠皮层于冷解剖液(4)中，剥离脑膜、血管，将脑组织剪成1 mm3的组织块，入0.1%胰酶液，3

11、7水浴消化20 min，加种植培养液 (DEME中添加10%胎牛血清，10%马血清，pH 7.27.4) 终止消化并吹打，细胞悬液经200目滤网过滤，获得单细胞悬液，1106/皿的密度接种于预先包被多聚赖氨酸的35 cm培养皿。第2天换维持培养液(神经元基础培养液中加2% B27），培养35 d半量换液，710 d用于实验。1.5 神经元的鉴定免疫组织化学染色标记NSE(北京中格公司产品)和IgG免疫荧光染色(FITC标记的兔抗鼠IgG 12 000稀释)鉴定神经元。1.6 参麦注射液对原代神经元活力的影响神经元活力测定采用MTT法。取前述原代神经元(细胞计数达1106/ml)，按每孔100

12、l 接种于96孔板，培养5 d后随机分组，设置空白对照组 (用来调零，只加培养基，不加细胞)、阴性对照组 (药物浓度为零，加细胞，加培养基)、治疗组 (加参麦注射液，加细胞，加培养基)，治疗组参麦注射液终浓度10 ml/L。分别继续培养1、2、3 d，每孔加入MTT 15 l，37孵育4 h，镜下观察形成紫色针状结晶，小心弃去上清，每孔加入DMSO 100 l，室温下放置10 min。待镜下观察紫色结晶全部溶解后，以Dynatech MR400 ELISA读数仪测定MTT吸光度值，检测波长570 nm，参考波长630 nm。1.7 流式细胞分析仪检测神经元凋亡及caspase3、9活性取上述分

13、组培养的神经元经胰蛋白酶消化后在4离心5 min，去上清后细胞沉淀用冷PBS洗2次，加195 l结合缓冲液悬浮细胞，然后加入Annexin VFTTC 5 l，室温避光孵育10 min，结合缓冲液洗3遍，190 l结合缓冲液重悬细胞，加10 l (20 g/ml) PI (终浓度1 g/ml)，上机检测，重复3次。取上述各组及阴性对照组细胞 (正常培养的细胞培养液中加1106/ml caspase3、9抑制剂共孵育) 消化、重悬，取300 l细胞悬液于EP管中，每管分别加入1 l FITC标记的caspase3、9，37 5% CO2恒温细胞培养箱孵育1 h，3 000 r/min离心5 mi

14、n，弃上清，0.5 ml缓冲液重悬细胞，3 000 r/min离心5 min，弃上清，300 l缓冲液重悬细胞，上机检测，重复3次。1.8 GRP78、Bcl2、细胞色素C免疫印迹分析各组细胞按照总蛋白提取试剂盒操作提取总蛋白，按蛋白定量试剂盒说明定量。免疫印迹操作参照Elyaman等1的方法进行。每组实验重复3次。利用激光扫描光密度分析法半定量测定细胞GRP78、Bcl2、细胞色素C水平变化。1.9 荧光分光光度计测钙浓度准备细胞数为106109/L，细胞存活率90%以上。负载Fura2/AM：将细胞与2 ml负载液及10 l Fura2/AM一起于37孵育30 min。无钙清洗液洗涤细胞后

15、荧光测定。37恒温测定荧光强度，连续测定340、380 nm波长激发光交替激发时，510 nm发射新的荧光强度F，同时记录荧光强度比值R(R=F340/F380)。校正参数Rmax为饱和时产生的最大荧光比值，以10% TritonX100测得。Rmin为游离时的最小荧光比值，以5 mmol/L测得。自身荧光以未孵育Fura2/AM的细胞同法测量，计算Ca2+i时减去。细胞胞质游离钙浓度Ca2+i计算：Ca2+i=Kd(RRmin)/(RmaxR) Ff2/Fb2。其中平衡常数Kd在37时为224 nmol/L，R为340、380 nm荧光强度比值(F340/F380)。校正参数分别为游离时形成的最大、最小荧光比值，Ff2与Fb2分别为游离与饱和380 nm荧光强度。1.10 统计学处理数据以xs表示。应用SPSS 12.0软件进行组间t检验。2 结 果2.1 原代神经元培养2.1.1 正