免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应用比较及常见问题分析 (2)ppt课件

1、免疫组化、免疫荧光、免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的运用比较流式细胞术的运用比较及常见问题分析及常见问题分析宋砚明宋砚明song_yanmingwuxiapptec免疫组化免疫组化IHCIHC的运用引见的运用引见免疫荧光免疫荧光IFIF的运用引见的运用引见流式细胞术流式细胞术FCFC的运用引见的运用引见IHCIHC、IFIF、FCFC区别与联络区别与联络免疫组织化学原理及特点免疫组织化学原理及特点利用抗原与抗体的特异性结合原理和特殊的标志利用抗原与抗体的特异性结合原理和特殊的标志技术，经过化学反响使标志抗体显色，对组织细技术，经过化学反响使标志抗体显色，对组织细胞内的特异性抗原进展定位、定性、

2、定量检测的胞内的特异性抗原进展定位、定性、定量检测的一门技术。一门技术。免疫组化具有操作简单，特异性强，敏感性高，免疫组化具有操作简单，特异性强，敏感性高，定位准确，形状与功能相结合等特点。定位准确，形状与功能相结合等特点。免疫组织化学免疫组织化学Immunohistochemistry, IHCImmunohistochemistry, IHC细细 胞胞抗抗原原一一抗抗二二抗抗辣根过氧化物酶HRP3 3，3-3-二氨联苯胺二氨联苯胺DABDAB显色剂显色剂棕褐色络合物IHC反响原理表示图反响原理表示图组织切片组织切片/芯片制造芯片制造2. 组织芯片运用领域组织芯片运用领域组织芯片的运用领域包

3、括与生命科学相组织芯片的运用领域包括与生命科学相关的根底研讨、临床研讨、运用研讨和关的根底研讨、临床研讨、运用研讨和新药开发等。新药开发等。免疫组化染色免疫组化染色IHC；原位杂交原位杂交ISH；荧光原位杂交荧光原位杂交FISH；原位末端标志分析原位末端标志分析TUNEL；原位原位PCR 以及激光捕获显微分别系统辅以及激光捕获显微分别系统辅助的助的cDNA杂交。杂交。1. 组织芯片组织芯片组织芯片或组织微阵列是将数十个组织芯片或组织微阵列是将数十个甚至上千个不同个体的组织标本集成在甚至上千个不同个体的组织标本集成在一张固相载体上，组织芯片中含有蛋白，一张固相载体上，组织芯片中含有蛋白，RNA及

4、及DAN分子，是一种高通量的研讨分子，是一种高通量的研讨分析工具。研讨者一次可有效利用成百分析工具。研讨者一次可有效利用成百上千份正常或疾病形状下的组织标本来上千份正常或疾病形状下的组织标本来研讨特定基因及其所表达的蛋白质与疾研讨特定基因及其所表达的蛋白质与疾病之间的关系。病之间的关系。3. Abgent 现有组织切片现有组织切片/芯片产品芯片产品全套鼠类器官组织切片；全套鼠类器官组织切片；全套猴类器官组织切片；全套猴类器官组织切片；人类常见癌症组织切片；人类常见癌症组织切片；组织芯片客户定制效力。组织芯片客户定制效力。组织芯片组织芯片/切片运用切片运用免疫组化流程表示图免疫组化流程表示图2.

5、 SP法法原理：根据生物素原理：根据生物素(Biotin) 与链霉亲和与链霉亲和素素(Streptavidin)具有强结合力的原理设具有强结合力的原理设计。在一抗兔源与鼠源与相应的靶计。在一抗兔源与鼠源与相应的靶抗原结合后，生物素化标志的抗多价二抗原结合后，生物素化标志的抗多价二抗与一抗特异结合；二抗上标志的生物抗与一抗特异结合；二抗上标志的生物素与标志了辣根过氧化物酶素与标志了辣根过氧化物酶HRP的的链霉亲和素结合，构成抗原特异性一链霉亲和素结合，构成抗原特异性一抗生物素化的二抗抗生物素化的二抗HRP 标志的链霉标志的链霉亲和素复合物。亲和素复合物。特点：该法孵育时间短通常为特点：该法孵育时

6、间短通常为10min，灵敏度高以及低背景染色等，灵敏度高以及低背景染色等特点。特点。1. SABC法法原理：原理：SABC法是利用链酶亲和素法是利用链酶亲和素(Streptavidin)与生物素与生物素(Biotin)特有的特有的高度亲和力这终身物学性质，先将生物高度亲和力这终身物学性质，先将生物素与辣根过氧化物酶素与辣根过氧化物酶(HRP)结合，构成结合，构成生物素化生物素化HRP，然后与链酶亲和素按一，然后与链酶亲和素按一定比例混合，构成定比例混合，构成SABC复合物。用生复合物。用生物素化二抗与第一抗体结合，再与物素化二抗与第一抗体结合，再与SABC复合物结合构成抗原抗体生复合物结合构成

7、抗原抗体生物素化二抗物素化二抗 SABC复合物。最后用底复合物。最后用底物显色剂显色。物显色剂显色。特点：该法具有灵敏度高以及低背景染特点：该法具有灵敏度高以及低背景染色等特点。色等特点。3. Polymer酶标二抗法酶标二抗法原理：该法采用一段多聚氨基酸聚合物原理：该法采用一段多聚氨基酸聚合物做为载体链，将该多聚物与二抗结合，做为载体链，将该多聚物与二抗结合，然后可再标志上多个然后可再标志上多个HRP/AP酶分子，酶分子，所以同样具有很高的信号放大作用。所以同样具有很高的信号放大作用。特点：灵敏度高；操作步骤简单；无需特点：灵敏度高；操作步骤简单；无需进展内源性的生物素封锁。进展内源性的生物

8、素封锁。IHC二抗原理及选择二抗原理及选择4. 直接酶标二抗法直接酶标二抗法该法是将该法是将HRP/AP酶分子直接标志于二酶分子直接标志于二抗上。因此需求普通的酶标二抗即可完抗上。因此需求普通的酶标二抗即可完成。实验简单，本钱低，但是由于没有成。实验简单，本钱低，但是由于没有信号放大作用，所以对很多表达丰度不信号放大作用，所以对很多表达丰度不是很高的抗原就能够检测不到。是很高的抗原就能够检测不到。IHC常用酶标二抗原理表示图常用酶标二抗原理表示图2. AEC显色法显色法产品描画：产品描画：3-氨基氨基-9-乙基咔唑乙基咔唑(3-amino-9-ethylcarbazole，AEC) 是过氧化物

9、酶是过氧化物酶 (Peroxidase) 的显色底物，在过氧化物的显色底物，在过氧化物酶的催化下，酶的催化下，AEC显色任务液会于反响显色任务液会于反响部位产生溶于酒精的红色沉淀，必需在部位产生溶于酒精的红色沉淀，必需在水溶性介质中复染和封片。本试剂盒适水溶性介质中复染和封片。本试剂盒适用于辣根过氧化物酶用于辣根过氧化物酶HRP系统的免系统的免疫组化显色，包括疫组化显色，包括AEC显色原和与之配显色原和与之配套的稀释液。套的稀释液。试剂盒组成：试剂盒组成：AEC显色原试剂显色原试剂A AEC底物缓冲液试剂底物缓冲液试剂B1. DAB显色法显色法产品描画：二氨基联苯胺产品描画：二氨基联苯胺( 3

10、，3-diaminobenzidine，DAB ) 是过氧化物是过氧化物酶酶 (Peroxidase) 的显色底物，在过氧化的显色底物，在过氧化物酶的催化下，物酶的催化下，DAB显色任务液会于反显色任务液会于反响部位产生不溶于酒精的棕褐色沉淀。响部位产生不溶于酒精的棕褐色沉淀。本试剂盒适用于辣根过氧化物酶本试剂盒适用于辣根过氧化物酶HRP系统的免疫组化显色。系统的免疫组化显色。试剂盒组成：试剂盒组成：DAB显色原显色原20试剂试剂A DAB底物缓冲液底物缓冲液1试剂试剂B3. BCIP/NBT显色法显色法产品描画：产品描画：BCIP/NBT5-溴溴-4-氯氯-3-吲吲哚磷酸哚磷酸/氮蓝四唑是一

11、种冷藏稳定的、氮蓝四唑是一种冷藏稳定的、单一组分溶液，用于免疫组化、原位杂单一组分溶液，用于免疫组化、原位杂交、交、western blot、northern blot和和southern blot，特异性地与碱性磷酸酶，特异性地与碱性磷酸酶AP反响生成紫色物质。反响生成紫色物质。试剂盒组成：试剂盒组成：有机溶剂中的有机溶剂中的5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚磷酸和氮吲哚磷酸和氮蓝四唑蓝四唑IHC显色方法原理及选择显色方法原理及选择4. BCIP/INT显色法显色法产品描画：产品描画：BCIP/INT5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚磷酸磷酸/p-碘硝基四唑是一种冷藏稳定的、碘硝基四唑是一种冷藏稳定

12、的、单一组分溶液，用于免疫组化、原位杂单一组分溶液，用于免疫组化、原位杂交、交、western blot、northern blot和和southern blot，特异性地与碱性磷酸酶，特异性地与碱性磷酸酶反响生成橙色反响生成橙色/棕褐色物质。棕褐色物质。 试剂盒组成：试剂盒组成：有机溶剂中的有机溶剂中的5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚磷酸和吲哚磷酸和p-碘硝基四唑碘硝基四唑免疫组织化学结果分析免疫组织化学结果分析2.非特异性显色非特异性显色石蜡切片脱蜡不彻底，建议延伸脱蜡时石蜡切片脱蜡不彻底，建议延伸脱蜡时间。间。操作过程中冲洗不充分，建议添加冲洗操作过程中冲洗不充分，建议添加冲洗的次数与冲洗时

13、间。的次数与冲洗时间。组织富含内源性的生物素与过氧化物酶，组织富含内源性的生物素与过氧化物酶，建议运用相关试剂进展封锁。建议运用相关试剂进展封锁。发生抗原异位。发生抗原异位。蛋白封锁不充分，建议添加蛋白封锁时蛋白封锁不充分，建议添加蛋白封锁时间。间。1.显色过深显色过深一抗浓度过高或孵育时间过长，建议降一抗浓度过高或孵育时间过长，建议降低一抗浓度或减少孵育时间。低一抗浓度或减少孵育时间。孵育温度过高，建议室温或孵育温度过高，建议室温或4孵育。孵育。HRP标志二抗孵育时间过长，建议缩短标志二抗孵育时间过长，建议缩短时间。时间。3.显色强度弱显色强度弱一抗浓度过低或孵育时间过短，建议添一抗浓度过低

14、或孵育时间过短，建议添加一抗浓度或延伸孵育时间。加一抗浓度或延伸孵育时间。试剂超越保质期，建议实验前确认试剂试剂超越保质期，建议实验前确认试剂的保质期。的保质期。操作过程冲洗过度，建议适度冲洗。操作过程冲洗过度，建议适度冲洗。免疫组织化学常见问题分析免疫组织化学常见问题分析4.无染色无染色组织中无目的抗原的表达。组织中无目的抗原的表达。一抗种属来源与二抗不匹配，建议实验一抗种属来源与二抗不匹配，建议实验前确认一抗的种属来源。前确认一抗的种属来源。显色物质与显色物质与HRP系统不匹配，建议实验系统不匹配，建议实验前确认显色体系。前确认显色体系。免疫荧光原理及特点免疫荧光原理及特点免疫荧光就是利用

15、抗原与抗体的特异性结合原理及特殊的荧免疫荧光就是利用抗原与抗体的特异性结合原理及特殊的荧光素标志技术，经过激光激发使荧光素发出荧光，在荧光显光素标志技术，经过激光激发使荧光素发出荧光，在荧光显微镜下察看荧光的变化从而对细胞内的抗原进展分析的技术。微镜下察看荧光的变化从而对细胞内的抗原进展分析的技术。用免疫荧光显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方用免疫荧光显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞或组织技术。法称为免疫荧光细胞或组织技术。免疫荧光具有特异性强、敏感性高、速度快等特点。免疫荧光具有特异性强、敏感性高、速度快等特点。免疫荧光免疫荧光Immunofluoresc

16、ence, IFImmunofluorescence, IF免疫荧光原理表示图免疫荧光原理表示图免疫荧光实验过程免疫荧光实验过程 细胞爬片多聚赖氨酸处置，生长密度细胞爬片多聚赖氨酸处置，生长密度70-80%70-80% 细胞固定适宜的固定液，如细胞固定适宜的固定液，如4%4%甲醛溶液等甲醛溶液等 细胞膜穿透细胞膜穿透 Triton X-100 Triton X-100 等等 封锁封锁3%BSA-PBS3%BSA-PBS等等 一抗孵育一抗孵育 荧光二抗孵育荧光二抗孵育 胞浆胞浆/ /核衬染鬼笔环肽核衬染鬼笔环肽/DAPI/PI/DAPI/PI 封片荧光显微镜拍照封片荧光显微镜拍照 免疫荧光结果分

17、析免疫荧光结果分析免疫荧光双染色抗体的选择免疫荧光双染色抗体的选择直接法：直接法：一抗种属来源无要求一抗种属来源无要求标志两种不同荧光素的标志两种不同荧光素的一抗。一抗。间接法：间接法：一抗种属来源来源不同一抗种属来源来源不同二抗分别标志不同荧光二抗分别标志不同荧光素。素。细胞核衬染染料：细胞核衬染染料：DAPIDAPI是一种可以与是一种可以与DNADNA强力结合的荧光染料它可以透过完好的细胞膜，因此强力结合的荧光染料它可以透过完好的细胞膜，因此以用于活细胞和固定细胞的染色。最大吸收波长为以用于活细胞和固定细胞的染色。最大吸收波长为358nm358nm，最大发射波长为，最大发射波长为461nm

18、461nm，其发散光的波长范围含盖了蓝色至青绿色。，其发散光的波长范围含盖了蓝色至青绿色。Hoechst 33342 Hoechst 33342 是一种是一种DNADNA结合型荧光染料结合型荧光染料, ,可以嵌合到碱基分子中可以嵌合到碱基分子中, ,在紫在紫外激发光作用下发出兰色荧光外激发光作用下发出兰色荧光. .可以透过完好的细胞膜，可用于活细胞染色。可以透过完好的细胞膜，可用于活细胞染色。碘化丙啶碘化丙啶(PI)(PI)是一种溴化乙啶的类似物，它在嵌入双链是一种溴化乙啶的类似物，它在嵌入双链DNADNA后释放红色荧光。后释放红色荧光。虽然虽然PIPI不能经过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜

19、而对核染色。不能经过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。PI-DNAPI-DNA复合物的激发和发射波长分别为复合物的激发和发射波长分别为535nm535nm和和 615nm 615nm。细胞浆衬染染料：细胞浆衬染染料：鬼笔环肽鬼笔环肽phalloidin phalloidin 由鬼笔鹅膏真菌由鬼笔鹅膏真菌Amanita phalloidesAmanita phalloides产生产生的一种环肽。可与的一种环肽。可与F F肌动蛋白结合，使肌动蛋白结合，使F F肌动蛋白坚持稳定。其荧光标志物肌动蛋白坚持稳定。其荧光标志物是鉴定是鉴定F F肌动蛋白的重要试剂。肌动蛋白的重要试剂。荧光抗体的选

20、择：荧光抗体的选择：绿色荧光素：绿色荧光素：FITCFITC，Alex488Alex488，Dylight488Dylight488等。等。红色荧光素：红色荧光素：PEPE，Alex546Alex546等。等。各种荧光染料原理及选择各种荧光染料原理及选择2.信号弱或无信号信号弱或无信号无目的蛋白或表达量极少，建议选用表无目的蛋白或表达量极少，建议选用表达量高的细胞或组织。达量高的细胞或组织。细胞通透性差，建议添加通透剂的作用细胞通透性差，建议添加通透剂的作用时间或浓度。时间或浓度。一抗一抗/二抗浓度太低，建议增大其浓度。二抗浓度太低，建议增大其浓度。二抗选择错误种属不匹配，建议选二抗选择错误种

21、属不匹配，建议选用与一抗种属相匹配的二抗。用与一抗种属相匹配的二抗。1.背景过高背景过高一抗质量不高，建议运用特异性高、效一抗质量不高，建议运用特异性高、效价高的一抗。价高的一抗。一抗一抗/二抗浓度太高，建议降低一抗二抗浓度太高，建议降低一抗/二抗二抗浓度。浓度。封锁不完全，建议添加蛋白封锁时间。封锁不完全，建议添加蛋白封锁时间。洗涤不充分，建议添加冲洗次数与时间。洗涤不充分，建议添加冲洗次数与时间。可经过调理荧光显微镜的参数来减低背可经过调理荧光显微镜的参数来减低背景。景。3.荧光猝灭快荧光猝灭快荧光素本身特性决议，光稳定性差，建荧光素本身特性决议，光稳定性差，建议选用光稳定性好的荧光素二抗

22、。议选用光稳定性好的荧光素二抗。用普通的封片剂封片，建议选用防荧光用普通的封片剂封片，建议选用防荧光猝灭剂封片。猝灭剂封片。免疫荧光常见问题分析免疫荧光常见问题分析4.细胞有自发荧光细胞有自发荧光运用了戊二醛固定，建议在固定后荧光运用了戊二醛固定，建议在固定后荧光染色前进展荧光淬灭，如运用染色前进展荧光淬灭，如运用NaIO4，NaBH4，甘氨酸等，染色前检查自发荧，甘氨酸等，染色前检查自发荧光。光。资料本身如石蜡有自发荧光，建议资料本身如石蜡有自发荧光，建议设立阴性对照，经过降低荧光显微镜的设立阴性对照，经过降低荧光显微镜的参数来消除背景染色。参数来消除背景染色。 细胞成分中可以产生自发荧光的

23、分子细胞成分中可以产生自发荧光的分子例如核黄素、细胞色素等的含量高；例如核黄素、细胞色素等的含量高；培育细胞中死细胞活细胞比例高；培育细胞中死细胞活细胞比例高；流式细胞术定义及原理流式细胞术定义及原理流式细胞仪流式细胞仪FLOW CYTOMETORFLOW CYTOMETOR： 进展流式细胞分析的仪器，是集光电子物理，光电丈量，进展流式细胞分析的仪器，是集光电子物理，光电丈量，计算机，细胞荧光化学，抗体技术为一体的高科技细胞计算机，细胞荧光化学，抗体技术为一体的高科技细胞分析仪。分析仪。流式细胞术流式细胞术FLOW CYTOMETRYFLOW CYTOMETRY: : 利用流式细胞仪对处于快速

24、流动的细胞或生物颗粒进展多利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进展多参数、快速每秒可达参数、快速每秒可达1000-100001000-10000个的定量分析和分个的定量分析和分选纯度可达选纯度可达99%99%以上的技术。以上的技术。流式细胞术流式细胞术Flow Cytometry, FCFlow Cytometry, FC细细 胞胞抗抗原原一一抗抗二二抗抗荧光物质荧光物质FITC,PEFITC,PE等等不同颜色的不同颜色的激发光激发光FCFC反响原理表示图反响原理表示图激光源激光源转化为计算机转化为计算机识别数据识别数据流式细胞仪任务原理图流式细胞仪任务原理图流式细胞术实验过程流式细胞

25、术实验过程 细胞悬浮液制备浓度为细胞悬浮液制备浓度为1 15 5106106个个/ml/ml 细胞固定适宜的固定液，如细胞固定适宜的固定液，如4%4%甲醛溶液等甲醛溶液等 细胞膜穿透细胞膜穿透 冰冷的甲醇等冰冷的甲醇等 封锁封锁3%BSA-PBS3%BSA-PBS等等 一抗孵育一抗孵育 荧光二抗孵育荧光二抗孵育 流式细胞仪分析流式细胞仪分析人外周全血细胞双参数散点图人外周全血细胞双参数散点图直方图：单参数分析直方图：单参数分析流式细胞术常见结果分析流式细胞术常见结果分析散点图：多参数分析散点图：多参数分析常用细胞表型及意义：常用细胞表型及意义：Cluster of Cluster of Dif

26、ferentiation, CDDifferentiation, CDCD3 CD3 总总T T细胞细胞CD4 TCD4 T辅助辅助/ /诱导细胞亚群诱导细胞亚群CD8 TCD8 T抑制抑制/ /细胞毒细胞亚群细胞毒细胞亚群CD19 BCD19 B细胞抗原细胞抗原LL: CD3-CD4- B细胞群细胞群+细细胞毒胞毒T细胞亚群细胞亚群LR：CD3+CD4- 细胞毒细胞毒T细胞细胞亚群亚群UR：CD3+CD4+ T辅助细胞辅助细胞亚群亚群UL 0.70 UR 24.2LR22.3LL 52.80 荧光补偿示原理荧光补偿示原理荧光补偿是指修正荧光渗漏的过程，如从探测器出去除匹配荧光以外的任何荧光信

27、号。当采用两种或两种以上荧光标志时如FITC,PE，当携带两种荧光素的细胞遭到激光照射激发时，将发出两种不同波长的荧光。然而，荧光染料所发出的荧光都具有一定的波长范围宽发射谱性质，虽然各自的荧光峰值不同，但发射谱范围会有一定的重叠。因此就会呵斥不同通道之间的荧光干扰，对实验结果呵斥影响。荧光补偿表示图荧光补偿表示图Annexin V-FITC/PI凋亡检测原理凋亡检测原理在细胞凋亡早期，磷脂酰丝氨酸Phosphatidylserine，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的外表，暴露在细胞外环境中。Annexin V是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与磷脂酰丝氨酸PS高亲和力特异性结合。将Annexin V进展荧光素FITC、PE或Biotin标志，以标志了的Annexin V-FITC作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶Propidium Iodide，PI是一种核酸染料，它不能透过完好的细胞膜，但在细胞凋亡