串联重复核定位信号的绿色荧光蛋白融合载体的构建与原核表达

1、串联重复核定位信号的绿色荧光蛋白融合载体的构建与原核表达        【摘要】     目的： 构建绿色荧光蛋白-串联重复核定位信号融合蛋白的表达载体（HisEGFP3xNLS），并在原核细胞中进行表达与纯化。方法： 采用PCR方法从原先克隆在pEGFPC1载体中的3xNLS与EGFP编码序列扩增出来，使用常规酶切和连接方法将其重组至pET14b载体中，对阳性克隆进行酶切、PCR和测序鉴定。转化BL21(DE3)大肠杆菌株，用IPTG诱导融合蛋白表达，并利用NiN

2、TA亲和层析纯化该融合蛋白。结果： 构建的HisEGFP3xNLS融合蛋白表达载体是正确的，该载体可在大肠杆菌内高效表达，用NiNTA纯化获得了相对分子质量约36 kD的融合蛋白。结论： 成功构建了HisEGFP3xNLS融合蛋白表达载体，并在原核细胞中获得了高效表达和纯化，为进一步研究NLS介导信号分子入核提供了实验材料。     【关键词】  核定位信号 载体蛋白质类 基因表达 蛋白纯化    Construction and Prokaryotic Expression of Green Fluor

3、escent Protein Fusion Vector of Tandem Nuclear Localization Signals    DENG Peng, CHEN Tengxiang, GONG Xiaowei    Department of Pathophysiology and Key Laboratory of Proteomics of Guangdong Province, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong, ChinaAbstrac

4、t Objective: To construct the expression vector of HisEGFP3xNLS fusion protein and obtain its expression and purification in E. coli. Methods： 3xNLS and EGFP sequence was amplified by PCR from pEGFPC13xNLS vector and cloned into pET14b vector following the routine procedures. After identification by

5、 enzyme digestion, PCR and sequencing, the positive clones were transformed into BL21 (DE3) competent cells, and the expression of HisEGFP3xNLS fusion protein was induced with IPTG and further purified by NiNTA affinity chromatography. Results: The constructed HisEGFP3xNLS fusion protein vector high

6、ly expressed in E. coli. With NiNTA affinity chromatography, a purified His fusion protein with relative molecular mass of approximately 36 kD was obtained. Conclusion: The expression vector of HisEGFP3xNLS fusion protein is constructed, expressed and purified under nondenaturing conditions, which m

7、ay significantly facilitate future study of the mechanism by which NLS mediate the nuclear translocation of certain signal molecules.Key words nuclear localization signal; carrier proteins; gene expression; protein purification    信号转导的时空特征，即信号蛋白的亚细胞定位（subcellular localization）和激活后移位（

8、translocation）已成为目前细胞信号转导研究的热点领域1，2，信号分子的特异性亚细胞定位有助于细胞高效经济地完成各种正常生理功能和病理反应。在刺激诱导的多种不同信号分子的移位入核过程中，核定位信号（nuclear localization signal, NLS）都扮演着重要的角色24，但目前NLS与核孔复合体（nuclear pore complex, NPC）的相互作用介导信号分子入核的具体机制仍未完全阐明。本实验构建了与增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP）融合的3个串联重复的NLS融合蛋白原核表达载体，为研究NL

9、S介导信号分子入核的机制提供了一个重要的工具。1  材料和方法1.1  质粒 带有三个串联重复的NLS（3xNLS）增强型绿色荧光蛋白载体pEGFPC1由挪威Troms大学Seternes教授馈赠，该质粒中3xNLS的序列为aggaagaggaagctgctgaggaagaggaagctgctgaggaagaggaagctgctg，利用Hind III和Pst I克隆在pEGFPC1中。将质粒转化大肠杆菌株DH5，提取质粒DNA，用DNA/RNA定量仪测定DNA浓度，置-20 保存备用。pET14b质粒和大肠杆菌株BL21(DE3)由本室保存。1.2 

10、主要试剂 QIAprep Spin Miniprep Kit和NiNTA亲和树脂是QIAGEN公司产品，限制性内切酶(Nde I、BamH I)、T4 DNA连接酶和Pyrobest高保真DNA聚合酶购自TaKaRa公司，100 bp和 1 kb DNA ladder分别是Toyobo公司和Stratagene公司产品，异丙基-D-硫代半乳糖（isopropylDthiogalactoside, IPTG）购自SigmaAldrich公司，引物由英骏公司合成。1.3  HisEGFP3xNLS融合载体的构建 见图1。从pEGFPC13xNLS载体中扩增EGFP和3

11、xNLS所用的上游引物序列为5tacatatgatggtgagcaagggcgaggagct3，其中下划线部分是EGFP基因编码序列的第123位碱基；下游引物序列为5taggatccttacgggcccgcggtaccgtcgactgca3，其中下划线部分是添加的终止密码子及pEGFPC1载体上BamH I位点前的25位碱基的反向互补序列。用Pyrobest高保真聚合酶进行PCR反应（95 30 s, 55 30 s,72 60 s，共30个循环），扩增片段大小为848 bp。将PCR产物用Nde I和BamH I酶切，随后与Nde I和BamH I双酶切并电泳切胶回收的pET14b连接，将连

12、接反应混合物转化大肠杆菌株DH5。挑取单菌落接种于Amp+的LB培养基中，37 振摇过夜。取5 ml菌液用QIAprep Spin Miniprep Kit小量提取质粒后，用Nde I和BamH I酶切鉴定。另外使用上述引物对重组体进行PCR鉴定。酶切及PCR鉴定产物用1.2 %琼脂糖凝胶电泳，并在凝胶图像分析仪上成像。重组体最终经测序鉴定无误后，置-20 保存备用。1.4  HisEGFP3xNLS融合蛋白的原核表达及纯化  将阳性重组质粒转化大肠杆菌株BL21(DE3)。挑取单菌落，置于2 ml LB(Amp+)培养基中，37 振摇培养至D600约为0.6时，加入终浓度

13、为0.1 mmol/L的IPTG诱导，继续振摇3 h。利用12 % SDSPAGE来鉴定表达融合蛋白的菌落。对有HisEGFP3xNLS融合蛋白表达的菌落进行大量（100 ml）菌液扩增诱导，6 000×g、4 离心10 min；将细菌沉淀重悬于4 ml结合缓冲液（300 mmol/L NaCl, 50 mmol/L NaH2PO4, 10 mmol/L咪唑, 0.1% TritonX 100, pH8.0）中，超声破碎，15 000×g, 4 离心15 min。将上清加入100 l NiNTA亲和树脂中4 孵育1 h，然后用1 ml的洗涤缓冲液（300 mmol/L Na

14、Cl, 50 mmol/L NaH2PO4, 20 mmol/L咪唑, pH8.0）洗NiNTA亲和树脂3次；最后用洗脱缓冲液（300 mmol/L NaCl, 50 mmol/L NaH2PO4, 250 mmol/L咪唑, pH8.0）洗脱蛋白后，12% SDSPAGE鉴定结果。    2  结果2.1  HisEGFP3xNLS融合载体的鉴定 电泳结果表明有约0.85 kb和4.7 kb两个条带，符合插入片段的大小（图2A）。用特异性引物进行PCR反应扩增出约0.85 kb的条带，也符合预计结果（图2B）。测序结果（用T7 pr

15、omoter primer和T7 terminator primer双向测通）证实插入到pET14b载体中的目的片段是正确的。2.2  HisEGFP3xNLS融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达和纯化 经IPTG诱导后，细菌裂解液在约36 kD处形成一条浓密的蛋白条带，与预期的HisEGFP3xNLS融合蛋白大小一致。利用NiNTA亲和层析法对细菌裂解液进行纯化后，在约36 kD处得到一条唯一的蛋白条带（图3）。3  讨论    许多信号通路激活的最终结果都可引起细胞的基因表达发生改变，这通常需要在信号通路被激活时，该级联中的某种蛋白从细

16、胞质移位到细胞核中，通过作用于其下游底物引起特异性的基因转录。真核细胞可以通过多种机制迅速诱导蛋白质从胞质移位入核5。影响蛋白质在胞质和胞核中分布主要包括两个因素，即与核转运机器或锚定蛋白的相互作用6，7。对于某种信号蛋白而言，如果其分布于胞质中，且核输入速率低于核输出速率，那么当其与输入受体-输入素的结合增加，与输出受体-输出素的结合降低，或两者同时存在时将迅速移位入核8。    蛋白进出细胞核都必须通过NPC，小于50 kD的分子能通过核孔自由扩散进出核，而大一些的分子则需要一个NLS4。NLS一般具有如下特征：（1）长度一般小于20个氨基酸；（2）在蛋白入核

17、内后不被移除；（3）通常富含带正电的（碱性）氨基酸。除此之外，NLS之间不存在一致的序列9。核输入过程可分为三个步骤。首先，位于胞质中的货物（需要移位入核的蛋白质，具有NLS或与具有NLS的蛋白质结合）与输入素结合，形成的货物-输入素复合体，随后被靶向到NPC上。移位过程需要小分子量GTP酶Ran、GTP的参与和生理温度，目前该过程的具体机制尚未阐明。入核后，货物-输入素复合体在RanGTP与输入素结合后解离。货物在核中被卸下，而输入素返回到胞质中进行下一轮的转运。因而，NLS对于蛋白质移位入核具有重要作用4。研究表明，p38调节/激活蛋白激酶/MAPK激活蛋白激酶5移位入核依赖于其C末端的NLS10。    Seternes等利用三个串联重复NLS序列与EGFP融合的真核表达载体证实了p38通过与其下游底物MK5的结合和对其的激活来参与其核-胞质分布的调控11。为了研究NLS在介导蛋白质入核中的确切机制（例如通过某些抑制剂的使用）