川渝部分地区野生黄鳝RAPD引物筛选及其在绵阳群体的验证

1、川渝部分地区野生黄鳝RAPD引物筛选及其在绵阳群体的验证蔡 欣 张海容12(1.西南科技大学生命科学与工程学院 四川绵阳 621010;2.德州学院农学系 山东德州 253023)摘要:采用RAPD技术对产自四川绵阳、内江、雅安和重庆忠县的24尾野生黄鳝基因组DNA进行引物筛选,40条随机引物中有4条引物扩增出片段。选择在4个地区黄鳝个体间多态性较丰富的RAPD引物A10在绵阳黄鳝群体进行扩增分析。RAPD引物A10在6个绵阳黄鳝个体的扩增,产生比较清晰的条带并且呈现一定的多态性,绵阳黄鳝群体内的平均遗传相似率为0.8947,群体内的平均遗传距离为0.1053,从一定程度反映出绵阳地区黄鳝较低

2、的遗传多样性。本研究所筛选引物可为黄鳝分子标记和遗传多样性的分析、亲缘关系和种质的鉴定以及遗传资源的保护利用提供参考。关键词:野生黄鳝 RAPD 多态引物筛选中图分类号:Q75 文献标志码:A 文章编号:1671-8755(2010)04-0096-04ScreeningofRAPDpolymorphicPrimersforWildMonopterasalbusfromSomeRegionsofSichuanandChongqingandVerificationinMianyangPopulationCAIXin,ZHANGHa-irong12(1.SchoolofLifeScienceand

3、Engineering,SouthwestUniversityofScienceandTechnology,Mianyang621010,Sichuan,China;2.DepartmentofAgronomy,DezhouUniversity,Dezhou253023,Shandong,China)Abstract:RandomamplifiedpolymorphicDNA(RAPD)techniquewasemployedtoinvestigatethepoly-morphismsof24wildricefieldeelsfromMianyang,Neijiang,Ya-ancityand

4、ZhongxianCountyofChongqing.FortyRAPDprimerswereusedandonlyfourofthemwerefoundtoproduceDNAfragments.Keywords:WildMonopterasalbus;RAPD;Selectionofpolymorphicprimers黄鳝隶属于合鳃鱼目(SynbranchiForm),合鳃鱼科(Sybranchidae),黄鳝属(Monopterus)。黄鳝属在全世界共有6个种,广泛分布于亚洲东部及南部各国,分布于我国的是M.albus。由于栖息地污染和过度捕捞,野生黄鳝资源急剧下降,因此,了解不同野生黄

5、鳝种群以及群体内个体间存在的遗传变异,对保护我国的野 收稿日期:2010-04-27基金项目:西南科技大学博士研究基金(编号:06zx7121)资助。 作者简介:蔡欣(1972),男,博士,副教授,研究方向:动物分子遗传学。E-mai:lcaixin2323。第4期 蔡 欣,等:川渝部分地区野生黄鳝RAPD引物筛选及其在绵阳群体的验证97生黄鳝种质资源的研究以及遗传资源的保护具有现实意义。RAPD就是随机扩增多态性DNA,它以PCR为基础,利用人工合成的约10bp的随机序列寡核苷酸作引物,以生物的基因组DNA为模板,进行PCR扩增,1产生不连续的DNA产物,通过琼脂糖凝胶电泳来检测DNA序列的

6、多态性。RAPD标记的优点是简单易行,扩增的周期短,需要的DNA量少,无放射性;标记数量多,可覆盖基因组中所有座位;合成的引物可用于任何生物基因组的分析,有商业化的成套引物试剂盒出售。因此,此种标记已广泛用于猪的种群分类鉴定、遗传连锁图谱的建立、基因定位、杂种优势分析和标记辅助选择。目前利用分子标记对黄鳝遗传多样性2的研究较少,贺顺连等(2004)通过RAPD对3个黄鳝物种,即湖南沅江的M.albus,缅甸仰光的M.cuch-ia和印度尼西亚的M.fossorius,进行遗传多样性分析,测到315个位点,遗传多样性指数为0.1575,相似度系数为0.2879,表明3种黄鳝具有较高的遗传变异。尹

7、绍武等(2005)3采用RAPD标记对采自湖南洞庭湖稻区的黄鳝野生群体和养殖群体遗传结构进行初步研究,用24个随机引物在野生群体和养殖群体中分别扩增出259和251条DNA片段,其中多态性片段数分别为116和92条,野生群体的多态性位点比例和杂合度明显高于养殖群体。Caieta.l(2008)对四川3个地方(绵阳市、雅安市和内江隆昌)以及重庆忠县的野生黄鳝进行了mtDNAD-loop部分序列遗传多态性分析,发现所有59个个体的变异位点比较少,只定义了134个单倍型,所有个体类聚为一个单倍群,表现出单态性,说明这些地区黄鳝的遗传多样性比较低。本研究拟从四川野生黄鳝基因组筛选多态性RAPD引物,为

8、野生黄鳝的资源管理和保护提供基础资料和依据,丰富野生黄鳝的遗传多样性研究内容。1 试验材料与方法1.1 实验动物与样品采集从四川省绵阳市、雅安市、内江隆昌县以及重庆忠县野外捕捉体形特征具有一定差异的野生黄鳝共24尾(表1),剪取尾巴约1cm的肌肉组织后放生,将采到组织装入盛有75%的酒精的离心管后冷冻保存。1.2 特异引物设计所用RAPD随机引物(SBS-A1SBS-A20,SBS-B1SBS-B20)全部购自北京赛百盛生物技术有限公司。1.3 DNA的提取与PCR扩增基因组DNA的提取按照Cai等的方法进行,溶于TE缓冲液后取1LL通过琼脂糖凝胶电泳检测。PCR反应总体系25LL,其中10P

9、CR4表1 采样地点和样本情况Table1ListofMonopterusalbususedinthestudy地 点四川绵阳市重庆忠县四川雅安市四川内江市Total群体名称缩写MCYN经纬度104b77E/31b47N108b02E/30b18N102b97E/29b97N105b25E/29b64N样本量1244424buffer2.5LL,dNTPs(10mmol/L)2LL,模板DNA(20ng/LL)2LL,RAPD引物各1LL,TaqDNA聚合酶(5U/LL)0.2LL,超纯灭菌水17.3LL。PCR反应条件:94e预热变性7min,进入循环程序;94e变性40s,35e退火1mi

10、n,72e延伸1.5min,共进行40个循环;最后72e延伸7min,终止于4e。PCR扩增产物通过1.4%琼脂糖凝胶电泳检测分析。1.4 数据分析在数据统计时,仅记录清晰且重复性好的DNA扩增条带。根据Lynch的方法计算黄鳝群体内个体之间的遗传相似率,公式如下:Sxy=2Nxy/(Nx+Ny),S=2SxyN5Sxy是两个体间的遗传相似率,Nxy表示个体x和y之间共有的DNA扩增条带数,Nx和Ny分别是个体x和y的DNA扩增条带数;S是群体内的遗传相似率,为群体内所有两个体间遗传相似率的平均值。群体内的遗传距离D=1-S。98 西 南 科 技 大 学 学 报 第25卷 2 结果与分析2.1

11、 基因组DNA提取从12尾绵阳黄鳝肌肉组织提取的基因组DNA取样1LL经过1%琼脂糖凝胶电泳检测后,发现除3号信号比较弱外,其余个体呈现亮度较高的条带(图1),提取效果比较理想,可以用于PCR扩增分析。2.2 四川和重庆地区黄鳝RAPD引物的筛选从40条引物中筛选出4条能够在12个样本中扩增出多条片段,且条带清晰而稳定,可用于其他样本的基因组RAPD分析(图2)。从图2中可以看出,在引物A2扩增产物中,重庆忠县黄鳝、雅安黄鳝和绵阳黄鳝各一个个体具有多态性;在RAPD引物SBS-B18,重庆忠县黄鳝、内江黄鳝和雅安黄鳝各一个个体呈现出一定的多态性;在RAPD引物SBS-A12,重庆忠县黄鳝、内江

12、黄鳝和雅安黄鳝各一个个体只有一条扩增条带,因此不具有多态性;在RAPD引物A10,重庆忠县黄鳝、内江隆昌黄鳝和雅安黄鳝各一个个体也呈现出一定的多态性。2.3 绵阳黄鳝不同个体RAPD多态性分析为了验证上述RAPD引物在同一区域群体黄鳝中不同个体之间的遗传多态性,选择扩增条带较多、多态性在四个地区黄鳝个体间较丰富的RAPD引物SBS-A10在绵阳黄鳝群体进行扩增分析。结果显示:不同黄鳝个体产生比较清晰的条带,以及多态性DNA片段(图3),6尾绵阳黄鳝个体扩增的条带数见表2。表2 RAPD引物A10的扩增结果Table2TheresultofamplificationbyRAPDprimerSBS

13、-A10引物A10序列(5cy3c)GTGATCGCAG 扩增条带数及其个体数1 23143526根据SBS-A10在6个个体的扩增条带可以初步进行群体内个体之间遗传关系的分析。利用公式Sxy=2Nxy/(Nx+Ny)计算绵阳黄鳝群体内个体两两之间的遗传相似率(表3),可以得到6个体之间遗传相似率比较高,在0.751.00之间。绵阳黄鳝群体内的平均遗传相似率S=0.8947,群体内的平均遗传距离D=1-S=0.1053。3 讨论,第4期 蔡 欣,等:川渝部分地区野生黄鳝RAPD引物筛选及其在绵阳群体的验证99方法所得遗传标记是基因表达的产物,在基因组DNA上的覆盖面较窄,且受到发育阶段和环境条

14、件的影响,因而有其局限性。DNA分子标记所检测的是基因组遗传物质的本身,不仅结果直接可靠,而且灵敏度高,大大提高了结果的可靠性。大量研究表明,RAPD分析具有简便、灵敏度高、不需要DNA的序列信息等,可以有效地检测出种、品种及品系之间的遗传多态性6-7。表3 绵阳黄鳝群体内个体之间的遗传关系Table3GeneticrelationshipbetweenMonopterasalbusindividualsfromMianyang个体M1M6M8M9M11M12M1444443M61.0044443本研究采用RAPD技术对产自四川绵阳、内江、雅安和重庆忠县的野生黄鳝基因组DNA进行引物筛选,40

15、条随机引物中只有4条引物扩增出片段,而且其中SBS-A12在重庆忠县黄鳝、内江黄鳝和雅安黄鳝各一个个体只有一条扩增条带,扩增条带最多的SBS-A10也最多扩增出7条带,绵阳黄鳝群体内的平均遗传相似率为0.8947,群体内的平均遗传距离为0.1053,因此本研究结果从一个侧面反映出这些地区野生黄鳝遗传多样性较低。RAPD引物SBS-A10在6个绵阳黄鳝 个体的扩增,产生比较清晰的条带并且呈现一定的多态性,从一定程度反映出绵阳地区黄鳝较低5注:对角线数据为各个个体的DNA扩增片段数,下三角数据为不同个体之间共有的DNA扩增片段数,上三角数据为群体内个体两两之间的遗传相似率Sxy。的遗传多样性。此结

16、果与Caietal(2008)通过mtDNAD-loop高变区测序分析的结果相似,四川地区野生黄鳝具有较低的遗传多样性。产生这一结果的原因,一方面可能由于绵阳乃至四川省境内的野生黄鳝具有比较单一的类群,并且遗传分化程度比较低,没有与其他类群之间进行过基因交流而遗传多样性比较贫乏;另一方面,可能与野生黄鳝的生态习性有关,野生黄鳝属于定居性种类,近亲繁殖严重,经过长期的自然选择之后,可能出现纯度较高的个体。最后,由于本实验所选扩增用多态引物数量有限,多态性不丰富,由此也可能导致研究群体遗传多态性降低,因此需要筛选更多有效引物进一步研究。鱼类遗传多样性研究是评估鱼类资源质量和建立科学的鱼类种质资源管理规范的基础。本研究中RAPD扩增体系以及多态引物的筛选,对于进一步研究四川乃至全国野生黄鳝群体的遗传多样性、群体结构特征、遗传分化程度建立了实验研究分析体系,并为进一步探讨野生黄鳝遗传多样性以及对遗传资源的保护和良种的选育提供重要的参考。参考文献1 WilliamsJK,KubeilikAR,LivakKJ,eta.lDNAPolymorphismsAmplifiedbyArbitraryPrimersAreUsefulasGeneticsMarkersJ.NucleicAcidsRes,1990,18:65