第七章植物离体繁殖

1、第七章第七章 植物离体繁殖植物离体繁殖第一节第一节 概述概述 第二节第二节 植物快繁程序植物快繁程序第三节第三节 影响植物快繁的因素影响植物快繁的因素第四节第四节 植物快繁的商业化应用植物快繁的商业化应用 植物离体繁殖（植物离体繁殖（propagation in vitro）又称植又称植物快繁或微繁，物快繁或微繁，是指利用植物组织培养技术对外植是指利用植物组织培养技术对外植体进行离体培养，使其短期内获得遗传性一致的大体进行离体培养，使其短期内获得遗传性一致的大量再生植株的方法。量再生植株的方法。一、概念和特点一、概念和特点（一）概念（一）概念2第一节第一节 概述概述 1、繁殖效率高。繁殖效率高

2、。2、培养条件可控性强。培养条件可控性强。3、占用空间小。占用空间小。4、管理方便，利于自动化控制。管理方便，利于自动化控制。5、便于种质保存和交换。便于种质保存和交换。（二）特点（二）特点3二、植物快繁器官形成方式二、植物快繁器官形成方式 根据器官形成方式的不同，将植物器官的根据器官形成方式的不同，将植物器官的再生分为五种类型，即再生分为五种类型，即短枝发生型、丛生短枝发生型、丛生芽发生型、不定芽发生型、胚状体发生型芽发生型、不定芽发生型、胚状体发生型和原球茎发生型和原球茎发生型。 （一）短枝发生型（一）短枝发生型 短枝发生型短枝发生型是指外植体携带的带叶茎段，在适是指外植体携带的带叶茎段，

3、在适宜的培养环境中萌发，形成完整植株，再将其剪成宜的培养环境中萌发，形成完整植株，再将其剪成带叶茎段，继代再成苗的繁殖方法。带叶茎段，继代再成苗的繁殖方法。5（二）丛生芽发生型（二）丛生芽发生型 丛生芽发生型丛生芽发生型是指使外植体携带的顶芽或是指使外植体携带的顶芽或腋芽在适宜培养环境中不断发生腋芽而呈丛生腋芽在适宜培养环境中不断发生腋芽而呈丛生状芽，将单个芽转入生根培养基中，诱导生根状芽，将单个芽转入生根培养基中，诱导生根成苗的繁殖方法。成苗的繁殖方法。 丛生芽发生型是大多数植物快繁的主要途丛生芽发生型是大多数植物快繁的主要途径，它不经过愈伤组织，能使无性系后代保持径，它不经过愈伤组织，能使

4、无性系后代保持原品种的特性，在生产中普遍应用。原品种的特性，在生产中普遍应用。67（三）不定芽发生型（三）不定芽发生型 不定芽发生型不定芽发生型是指外植体在适宜培养是指外植体在适宜培养基和培养条件下，经过基和培养条件下，经过脱分化脱分化形成愈伤组形成愈伤组织，然后经过织，然后经过再分化再分化诱导愈伤组织产生不诱导愈伤组织产生不定芽，或外植体不形成愈伤组织而直接从定芽，或外植体不形成愈伤组织而直接从其表面形成不定芽，将芽苗转移到生根培其表面形成不定芽，将芽苗转移到生根培养基中，经培养获得完整植株的繁殖方法。养基中，经培养获得完整植株的繁殖方法。8 不定芽发生型也是许多植物快繁的主要方不定芽发生型

5、也是许多植物快繁的主要方式。由于不定芽形成的数量与腋芽数目无式。由于不定芽形成的数量与腋芽数目无关，其关，其增殖率增殖率高于丛生芽发生型。高于丛生芽发生型。 但经过愈伤组织途径或者但经过愈伤组织途径或者多次继代培养多次继代培养后后，容易导致细胞分裂不正常，容易导致细胞分裂不正常，增加变异增加变异植植株发生频率。如香蕉继代次数控制在株发生频率。如香蕉继代次数控制在8 8代之代之内，再生植株的变异率则可控制在内，再生植株的变异率则可控制在3%3%左右左右。9 表现表现嵌合性状嵌合性状的植株通过不定芽方式再生的植株通过不定芽方式再生时，往往导致时，往往导致嵌合性状发生分离嵌合性状发生分离而失去原而失

6、去原有价值。如观赏植物色彩镶嵌的叶子、带有价值。如观赏植物色彩镶嵌的叶子、带金边或者银边等性状的植物，通过不定芽金边或者银边等性状的植物，通过不定芽途径再生植株时，可能导致这些观赏性状途径再生植株时，可能导致这些观赏性状消失。这类植株快繁时，应通过消失。这类植株快繁时，应通过丛生芽途丛生芽途径径进行。进行。10ABEC花烛叶片离体培养及植株再生花烛叶片离体培养及植株再生11（四）胚状体发生型（四）胚状体发生型 胚状体发生型胚状体发生型是指外植体在适宜培养环境中，经是指外植体在适宜培养环境中，经诱导产生体细胞胚的繁殖方法诱导产生体细胞胚的繁殖方法 ，从而形成小植株的繁，从而形成小植株的繁殖方法。

7、殖方法。 分为分为间接途径间接途径（经愈伤途径）和（经愈伤途径）和直接途径直接途径两种。两种。 胚状体发生途径具有成苗数量大、速度快、结构胚状体发生途径具有成苗数量大、速度快、结构完整的完整的特点特点，因而是外植体，因而是外植体增殖系数最大的途径增殖系数最大的途径。12 体细胞胚体细胞胚再生的小植株与再生的小植株与丛生芽或不定芽丛生芽或不定芽再生的小植株相比，具有两个显著差异：再生的小植株相比，具有两个显著差异： 胚状体多起源于单细胞。胚状体多起源于单细胞。 生理隔离。生理隔离。13菊花花瓣体细胞胚胎发生及体胚发育过程的扫描电镜观察菊花花瓣体细胞胚胎发生及体胚发育过程的扫描电镜观察14（五）原

8、球茎发生型（五）原球茎发生型原球茎发生型原球茎发生型是兰科植物的一种快繁方式，是兰科植物的一种快繁方式，它是指茎尖或腋芽外植体经培养产生原球茎它是指茎尖或腋芽外植体经培养产生原球茎（即扁球状体、基部生假根）的繁殖类型。（即扁球状体、基部生假根）的繁殖类型。15 原球茎是兰花种子发芽过程中的一种形态原球茎是兰花种子发芽过程中的一种形态学构造。种子萌发初期并不出现胚根，只学构造。种子萌发初期并不出现胚根，只是胚逐渐膨大，以后种皮的一端破裂，肿是胚逐渐膨大，以后种皮的一端破裂，肿胀的胚呈小圆锥状，故称为胀的胚呈小圆锥状，故称为原球茎原球茎。 原球茎是短缩的、呈珠粒状的、由胚性细原球茎是短缩的、呈珠粒

9、状的、由胚性细胞组成的、类似嫩茎的器官，它可以增殖胞组成的、类似嫩茎的器官，它可以增殖，形成，形成原球茎丛原球茎丛。由。由茎尖或腋芽茎尖或腋芽外植体诱外植体诱导产生原球茎，切割原球茎进行增殖，或导产生原球茎，切割原球茎进行增殖，或停止切割使其继续培养而转绿，产生毛状停止切割使其继续培养而转绿，产生毛状假根，叶原基发育成幼叶，将其转移培养假根，叶原基发育成幼叶，将其转移培养生根，形成完整植株。生根，形成完整植株。1617植物快繁的程序包括四个阶段：植物快繁的程序包括四个阶段：无菌（或初代）培养的建立无菌（或初代）培养的建立繁殖体增殖繁殖体增殖芽苗生根芽苗生根小植株的移栽驯化小植株的移栽驯化18第

10、二节第二节 植物快繁程序植物快繁程序一、无菌培养的建立一、无菌培养的建立 这个阶段的任务是这个阶段的任务是母株和外植体的选取、母株和外植体的选取、无菌培养物的获得及外植体的启动生长无菌培养物的获得及外植体的启动生长，以利，以利于离体材料在适宜培养环境中以某种器官发生于离体材料在适宜培养环境中以某种器官发生类型进行增殖。类型进行增殖。19211.培养材料的增殖方式培养材料的增殖方式 五种方式。五种方式。(取决于取决于培养目的培养目的和和材料自身的可材料自身的可能性能性。) 一般大多数植物采用一般大多数植物采用无菌短枝或腋芽萌发或诱无菌短枝或腋芽萌发或诱导不定芽导不定芽产生，再以产生，再以芽繁殖芽

11、芽繁殖芽的方式进行增殖；兰的方式进行增殖；兰科植物、百合等则采用科植物、百合等则采用原球茎增殖途径原球茎增殖途径，以保障繁，以保障繁殖材料的遗传稳定性。殖材料的遗传稳定性。22二、增殖培养二、增殖培养2.增殖培养基增殖培养基 增殖率增殖率是植株快速繁殖特别是商业性繁殖的重要是植株快速繁殖特别是商业性繁殖的重要指标。外植体在每次继代培养中，应能产生最大数指标。外植体在每次继代培养中，应能产生最大数量的有效繁殖体。量的有效繁殖体。 基本培养基一般与启动生长培养基相同，而细胞基本培养基一般与启动生长培养基相同，而细胞分裂素和矿物元素的浓度水平则高于启动生长培养分裂素和矿物元素的浓度水平则高于启动生长

12、培养基。一般基。一般MS+BA 13 mg/ml+NAA0.11 mg/ml。233.增殖体的大小和切割方法增殖体的大小和切割方法 一般携带一个茎节，但第一次增殖的茎一般携带一个茎节，但第一次增殖的茎段一般都有段一般都有24个茎节。个茎节。 茎段可以垂直插入培养基中，但插入的茎段可以垂直插入培养基中，但插入的深度不应淹没茎节；或水平放入培养基表深度不应淹没茎节；或水平放入培养基表面，以刺激侧芽的萌动。面，以刺激侧芽的萌动。24青花菜增殖青花菜增殖枇杷增殖枇杷增殖2627三、芽苗生根三、芽苗生根 将单个芽苗转移到生根培养基或适宜环境中诱导生根。将单个芽苗转移到生根培养基或适宜环境中诱导生根。1.

13、离体生根（试管内生根）离体生根（试管内生根） 降低无机盐浓度（降低无机盐浓度（1/2MS或者或者1/4MS），减少或不需），减少或不需要细胞分裂素，增加生长素的浓度。要细胞分裂素，增加生长素的浓度。 对有些植物，如果芽苗在含有生长素的培养基中生长对有些植物，如果芽苗在含有生长素的培养基中生长12d，再转移至无生长素的培养基中，或芽苗在含生长，再转移至无生长素的培养基中，或芽苗在含生长素的生根溶液中浸蘸后直接插入无生长素的培养基中，湿素的生根溶液中浸蘸后直接插入无生长素的培养基中，湿度度85%以上，温度以上，温度25，弱光或黑暗条件。，弱光或黑暗条件。28292.活体生根（试管外生根）活体生根（

14、试管外生根） 芽苗先在生长素中快速浸蘸或在含有芽苗先在生长素中快速浸蘸或在含有相对高浓度生长素的培养基中培养相对高浓度生长素的培养基中培养510天，天，然后在温室中栽入培养基质，经常喷雾，然后在温室中栽入培养基质，经常喷雾，给予高湿度环境，几天后便可自行生根。给予高湿度环境，几天后便可自行生根。 30四、移栽驯化四、移栽驯化 试管小植株的移栽驯化是试管苗从异试管小植株的移栽驯化是试管苗从异养到自养的转变，有一个逐渐适应过程。养到自养的转变，有一个逐渐适应过程。移栽前需对试管植株进行高光强炼苗，使移栽前需对试管植株进行高光强炼苗，使植株生长粗壮，并打开瓶口，降低湿度，植株生长粗壮，并打开瓶口，降

15、低湿度，使其逐渐适应外界环境。使其逐渐适应外界环境。 1.移栽移栽 2.驯化管理驯化管理31.移栽移栽 首先应洗去小植株根部附着的培养基，避首先应洗去小植株根部附着的培养基，避免微生物的繁殖污染，造成小苗死亡。免微生物的繁殖污染，造成小苗死亡。 然后将小植株栽人人工配制的混合培养基然后将小植株栽人人工配制的混合培养基质中，基质用保湿又透气的材料，如蛭石质中，基质用保湿又透气的材料，如蛭石、珍珠岩、粗沙、泥炭等按比例混合，以、珍珠岩、粗沙、泥炭等按比例混合，以利小植株生长。几天后小植株可形成新的利小植株生长。几天后小植株可形成新的功能根系。功能根系。322.驯化管理驯化管理 移栽的试管小植株和活

16、体生根的小植株，移栽的试管小植株和活体生根的小植株，其其湿度的控制湿度的控制十分重要。因试管苗在高湿十分重要。因试管苗在高湿（90100的相对湿度）环境中生长，的相对湿度）环境中生长，茎叶表面防止水分散失的角质层等几乎全茎叶表面防止水分散失的角质层等几乎全无，根系又不发达，移栽后难以保证水分无，根系又不发达，移栽后难以保证水分平衡，即使根系周围有足够的水分也不行平衡，即使根系周围有足够的水分也不行。所以，应采用加覆塑料薄膜、经常喷雾。所以，应采用加覆塑料薄膜、经常喷雾的方法，提高小植株周围的空气湿度，减的方法，提高小植株周围的空气湿度，减少叶面蒸腾。同时，逐渐降低空气相对湿少叶面蒸腾。同时，逐

17、渐降低空气相对湿度，使其适应自然环境条件。度，使其适应自然环境条件。33 移栽小植株还应注意光、温控制。移栽小植株还应注意光、温控制。 移栽初期移栽初期光照强度光照强度应较弱，经过一段时间应较弱，经过一段时间适应后，增加光照强度（漫射），如适应后，增加光照强度（漫射），如1 5004 000 lx，甚至，甚至10000 lx。 移栽小植株生长所需的移栽小植株生长所需的适宜温度适宜温度与植物种与植物种类有关，喜温性植物以类有关，喜温性植物以25左右为宜左右为宜，喜，喜凉性植物则以凉性植物则以1820为好。温度过高导为好。温度过高导致蒸腾作用加强，水分失衡，微生物滋生致蒸腾作用加强，水分失衡，微生

18、物滋生等；温度过低则使幼苗生长迟缓或不易存等；温度过低则使幼苗生长迟缓或不易存活。如使基质温度高于空气温度活。如使基质温度高于空气温度23，则有利于生根和促进根系发育，提高存活则有利于生根和促进根系发育，提高存活率。率。34 此外，在移栽小植株的驯化管理阶段，还此外，在移栽小植株的驯化管理阶段，还应应防止菌类滋生防止菌类滋生，适当喷一定浓度的杀菌，适当喷一定浓度的杀菌剂（杀菌灵）可有效保护移栽小植株的正剂（杀菌灵）可有效保护移栽小植株的正常生长。常生长。3536第三节第三节 影响植物快繁的因素影响植物快繁的因素植物快繁的目的是以尽可能高的效率生产植物快繁的目的是以尽可能高的效率生产试管苗，获得

19、最大的经济效益。因此，在试管苗，获得最大的经济效益。因此，在快繁时应使各种影响因素处于最适合快繁快繁时应使各种影响因素处于最适合快繁的状态。的状态。37一、外植体一、外植体 外植体的来源外植体的来源：最适的为茎尖、带芽茎段，也可：最适的为茎尖、带芽茎段，也可以利用叶片、子叶、根段、花器官组织等。以利用叶片、子叶、根段、花器官组织等。 外植体生理年龄外植体生理年龄：幼嫩组织分化能力更强。：幼嫩组织分化能力更强。 外植体大小外植体大小：不能太小，否则影响成活率。除非：不能太小，否则影响成活率。除非是用于脱毒苗的生产。是用于脱毒苗的生产。38二、培养基二、培养基 基本培养基基本培养基：MS培养基应用

20、最为广泛。对于某些培养基应用最为广泛。对于某些植物及生根阶段，以植物及生根阶段，以1/4或或1/2MS较好。蔗糖和葡较好。蔗糖和葡萄糖浓度为萄糖浓度为2-4%。生根时稍低。生根时稍低。 植物生长调节剂植物生长调节剂：主要以细胞分裂素和生长素的：主要以细胞分裂素和生长素的配合使用，调节外植体的生长和分化。另外配合使用，调节外植体的生长和分化。另外ABA、GA、CCC等也具有不同的作用。等也具有不同的作用。 培养基的物理特性培养基的物理特性：以固体培养较为普遍，也有：以固体培养较为普遍，也有采用液体培养，如兰花原球茎的增殖。采用液体培养，如兰花原球茎的增殖。39三、培养条件三、培养条件 光照：光照

21、：1000-3000lx，阶段，阶段可增强。可增强。14-16h/d。 温度：温度：与植物的原产地相应。一般为与植物的原产地相应。一般为252。有时可。有时可进行高温或低温的预处理。进行高温或低温的预处理。 湿度：湿度：要求环境相对湿度不能太低，一般在要求环境相对湿度不能太低，一般在70-80%。 气体：气体：要求培养基及培养瓶通气良好，同时及时转接。要求培养基及培养瓶通气良好，同时及时转接。液体培养要求振荡培养，促进氧气交换。液体培养要求振荡培养，促进氧气交换。40四、继代培养四、继代培养 主要指对阶段主要指对阶段增殖形成的芽丛、胚状体或原增殖形成的芽丛、胚状体或原球茎等进行转接继代。继代间

22、隔时间一般为球茎等进行转接继代。继代间隔时间一般为2020天左右。天左右。41五、移栽五、移栽 根系结构不完善的试管苗移栽后不易存活。要求根系结构不完善的试管苗移栽后不易存活。要求根根系结构完整，具根毛，再生根的吸收能力强系结构完整，具根毛，再生根的吸收能力强。 叶表皮组织不发达的试管苗也不易移栽存活。移栽叶表皮组织不发达的试管苗也不易移栽存活。移栽要求打开瓶口驯化要求打开瓶口驯化2-3天；或在瓶内添加一些生长天；或在瓶内添加一些生长延缓剂如延缓剂如PP333、CCC等培育壮苗。等培育壮苗。42第四节植物快繁的商业化应用第四节植物快繁的商业化应用 植物快繁最重要的用途是进行植物的商业化植物快繁

23、最重要的用途是进行植物的商业化生产。生产。世界上快繁商业化开始于上个世纪美国的世界上快繁商业化开始于上个世纪美国的兰花工业兰花工业。我国的香蕉快繁苗占全国组培苗的。我国的香蕉快繁苗占全国组培苗的2/3。其次有甘蔗、兰花、马铃薯、甘薯等。其次有甘蔗、兰花、马铃薯、甘薯等。43园艺植物种苗工厂化生产园艺植物种苗工厂化生产44 一、商业化生产规模及工艺流程一、商业化生产规模及工艺流程1.试管苗生产规模的确定试管苗生产规模的确定 商业化生产商业化生产规模的确定应以规模的确定应以市场需求市场需求为标准。为标准。 试管苗生产试管苗生产规模的确定是以规模的确定是以无菌工作台和培养无菌工作台和培养架架的数量来

24、衡量的。年产的数量来衡量的。年产100万株，接种室万株，接种室4050m2，超净工作台超净工作台810台，培养室台，培养室100-120m2 。452.商业化实验室的设计商业化实验室的设计 根据已确定的根据已确定的生产规模生产规模和组织培养的和组织培养的生产程生产程序序，试管苗生产的实验室应尽量布局合理，使生，试管苗生产的实验室应尽量布局合理，使生产程序能连续、有效地进行。产程序能连续、有效地进行。（1 1）环境要求远离污染源）环境要求远离污染源 （2 2）水电、交通）水电、交通 （3 3）工艺流程工艺流程 （4 4）节能（）节能（5 5）无菌）无菌463.商业化生产的配套设施商业化生产的配套

25、设施 相应配套设施包括相应配套设施包括过渡培养室和露地炼苗场过渡培养室和露地炼苗场。474.商业化生产的工艺流程商业化生产的工艺流程 试管苗商业化生产的工艺流程是以其快繁程试管苗商业化生产的工艺流程是以其快繁程序为基础建立起来的，如最成熟的草莓脱毒苗生序为基础建立起来的，如最成熟的草莓脱毒苗生产流程和葡萄试管快繁流程。通过茎尖脱毒建立产流程和葡萄试管快繁流程。通过茎尖脱毒建立起来的草莓商业化试管苗生产，除必须配备的培起来的草莓商业化试管苗生产，除必须配备的培养和驯化等条件外，还应增加养和驯化等条件外，还应增加病毒鉴定室病毒鉴定室。48二、商业化生产及效益分析二、商业化生产及效益分析1.试管苗增

26、殖率的估算试管苗增殖率的估算 试管苗的增殖率多数以芽或苗为单位，但原球茎或胚试管苗的增殖率多数以芽或苗为单位，但原球茎或胚状体多以瓶为单位。状体多以瓶为单位。（1）增殖率的理论值）增殖率的理论值是指接种一个芽或一块增殖培养物，经是指接种一个芽或一块增殖培养物，经过一段时间培养后得到的芽或苗数。过一段时间培养后得到的芽或苗数。Y=mXn （Y年繁殖数，年繁殖数，m无菌母株苗数，无菌母株苗数，X每个培每个培养周期增殖的倍数，养周期增殖的倍数，n全年可增殖的周期数）全年可增殖的周期数） （2）增殖率的实际值）增殖率的实际值是指接种一个芽或一个苗，经过实际繁是指接种一个芽或一个苗，经过实际繁殖周期，得

27、到的实际芽或苗数。殖周期，得到的实际芽或苗数。 实际增殖数与理论增殖数出现很大差异的实际增殖数与理论增殖数出现很大差异的原因原因是：是：污染淘汰；污染淘汰；出售、转让和实验所用；出售、转让和实验所用；移栽死亡；移栽死亡；培养容器等设备的限制。培养容器等设备的限制。492.生产计划的制定和实施生产计划的制定和实施（1）生产计划的制定）生产计划的制定 商业化生产计划制定的依据是市场对试管商业化生产计划制定的依据是市场对试管苗的种类、品种及数量的需求及趋势，实验室苗的种类、品种及数量的需求及趋势，实验室具备的生产条件和规模。首先应提出全年销售具备的生产条件和规模。首先应提出全年销售目标，再根据实际生

28、产中各个环节的消耗，制目标，再根据实际生产中各个环节的消耗，制定出相应的全年生产计划，一般生产数量应比定出相应的全年生产计划，一般生产数量应比计划销售的数量增加计划销售的数量增加2030。 50（2）生产计划的实施）生产计划的实施 生产计划实施的步骤为：生产计划实施的步骤为：准备繁殖材料。准备繁殖材料。合格繁殖材料的快速增殖。合格繁殖材料的快速增殖。 存瓶增殖总瓶数存瓶增殖总瓶数月计划生产苗数每个增殖瓶月月计划生产苗数每个增殖瓶月可产苗数可产苗数 月计划生产苗数月计划生产苗数每个操作人员每天可接苗数每个操作人员每天可接苗数月月工作日工作日人员数人员数 控制试管苗生产中的增殖总瓶数，便于在一个控

29、制试管苗生产中的增殖总瓶数，便于在一个周期内全部更新一次培养基，使增殖材料处于不同周期内全部更新一次培养基，使增殖材料处于不同生长阶段的最佳状态，提高其质量。生长阶段的最佳状态，提高其质量。513.产品质量监控产品质量监控 如接种状况、污染率、生长情况、如接种状况、污染率、生长情况、生根苗数量、出瓶苗质量等，并建立试生根苗数量、出瓶苗质量等，并建立试管苗出瓶标准。管苗出瓶标准。524.商业化生产效益分析商业化生产效益分析53 试管苗商业化的试管苗商业化的生产成本应包括生产成本应包括：人工费用。人工费用。生产物资费用。生产物资费用。设备折旧费用。设备折旧费用。水电费用。水电费用。其他费用。其他费用。54三、降低商业化生产成本的措施三、降低商业化生产成本的措施55四、离体快繁商业性生产的范围及应用四、离体快繁商业性生产的范围及应用56兰科植物生产兰科植物生产57无菌苗快速繁殖无菌苗快速繁殖58无菌苗驯化无菌苗驯化5960五、商业化生产应注意的问题五、商业化生产应注意的问题1.污染污染 612.遗传稳定性遗传稳定性（1 1）影响遗传稳定性的因素）影响遗传稳