DNA序列测定(精)

1、DNA序列测定DNA 序列测定是在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的基础上建立起来的。可分离相差仅 1 个碱基的 300500bp 的核酸分子。常用测序方法：1. 双脱氧末端终止法1.1.1 测序原理 四个反应管中， 在 DNA 聚合酶催化下， 以单链 DNA 为模板，加入单引物、 四种dNTP ， 以及每管中加入双脱氧核糖核苷酸ddA、ddT、ddG、ddC。双脱氧核苷酸（ddNTP）的5端-OH是正常的，而其 3端-OH 则没有，因此能与引物延伸链的3端连接，而不能连接其后继核苷酸，于是引物链的延伸至此结束，经过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，根据电泳图谱即可拼 出所测 DNA序列。1.1.2

2、 测序步骤A 测序 DNA 模板制备 测序可分为单链测序与双链测序，对于未知序列可采用单链测序，而对于已知DNA 序列可采用双链测序。 但不管单链测序还是双链测序， 其测序反应都一样。 其中单链模板可通 过将待测 DNA 片段克隆到噬菌体 M13 中或通过不对称 PCR 制备 ；双链模板可通过将待测 DNA 片段克隆到质粒 DNA 中或通过 PCR 扩增制备。所得模板 DNA 应通过纯化处理才能 用于后继测序反应。B 测序引物的设计测序所用引物一般采用通用引物， 也可根据已有序列设计引物， 引物一般有 1530 个碱 基，应遵循一般引物设计原则a、G+C 含量为 45 55%。b、3 端最好以

3、 A 或 C 结尾，不要以 T 结尾。c、引物长度以 1530bp 为宜。d、引物本身不能形成二级结构。C 四种测序反应液的制备测序反应液组成：反应缓冲液、 DNA 聚合酶、Mgcl2、引物、纯水、四种 dNTP，分 别在四个反应管中加入一种相应 ddNTP。标记物：测序反应的标记物有核素和荧光染料。标记载体有引物、dNTP 、 ddNTP 。现在应用较多的是将荧光染料标记于引物或 ddNTP 上，因核素对环境的污染而逐渐 应用得比较少。但也可以不进行标记而采用银染系统检测。D 延伸反应引物在 DNA 聚合酶的催化下，按碱基互补原则逐步在引物的3端加上四种脱氧核糖核苷酸， 四个反应管中的 dd

4、NTP 随机地与 dNTP 竟争结合位点， 于是引物延伸链随机 终止在各个可能位点，在电泳图谱上形成一系列相差一个核苷酸的单链DNA 梯带。E 电泳与读序 反应产物与甲酰胺混和，并高温加热变性后，于变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。注：对于没有标记的测序反应，电泳完成后可用银染将 DNA 标记、拍照、读序。 对于用核素标记的测序反应，按核素操作规程拍照。对于用荧光染料标记的测序反应， 现有一些商业生物技术公司开发的测序仪可在电 泳过程中进行检测。1.1.3 末端终止法图示原理示意图TGCAACGTGCATACGTTGCACGTAA反应管C反应管G反应管T反应管AA CAC GACG TACGTTGC A

5、ACGTTG CACGTTGACGT TACGTTGCA CACGTTGCAC GACGTTGCACGTA电泳示意图A 泳道 C 泳道 G 泳道 T 泳道ACGTTGCACGTA ACGTTGCACGTACGTTGCACG ACGTTGCACACGTTGCA ACGTTGC ACGTTGACGTT ACGT ACGACA1.2 化学裂解法首先对待测 DNA 单链单侧末端进行放射性标记，再分成45 个反应体系，分别用不同的化学试剂处理，DNA 片段分别于某一种或某一类碱基处断裂，而断裂的碱基随机发生 于 DNA 片段上某种或某类碱基中的任何一个，且每一个 DNA 分子只有一处断裂点。电泳后,放射

6、自显影得到相互错落的梯形图谱，即可读出DNA 序列。1.2.1 原理G 反应：硫酸二甲脂 (DMS) 使鸟嘌呤 N7 甲基化。A+G 反应：甲酸使嘌呤环的氮质子化而使糖苷键被削弱，进而嘌呤环被吡啶取代。C+T 反应：肼裂解嘧啶环，导致其脱落。C 反应：在一定浓度的 NaCl 存在时，肼只对胞嘧啶起作用。 以上反应完成后，吡啶在加热条件下导致被修饰碱基处磷酸二脂键断裂。1.2.2 操作步骤ACGTTGCACG TA 待测单链 DNA 的纯化和标记B 碱基的特异性修饰C . 碱基的裂解D 上样电泳E 测序图谱识读1.2.3 化学裂解法的特点优点：所测序列直接来源于所测 DNA ，避免了 DNA 复

7、制中错误 dNTP 的掺入。 可直接对合成的寡核苷酸测序，可分析甲基化修饰等，以及研究 DNA 的二级结构及蛋 白质与 DNA 的相互作用等。缺点：操作复杂，读序困难。1.3 杂交测序1.3.1 原理 杂交测序是以基因芯片为基础的一种测序方法，将一段 DNA 片段分解为一系列相差一 个碱基的八聚体，将这些八聚体做成基因芯片与待测 DNA 杂交，根据杂交结果拼凑出所测 DNA 序列。见下图TCACGATCCTTAGGCAC 测序模板? AGTGCTAG? GTGCTAGG? TGCTAGGA?GCTAGGAA?CTAGGAA T? TAGGAATC?AGGAA TCC? GGAATCCG? GAATCCGT? AATCCGTG1.3.2 DNA测序分析ABI PRISM 310 遗传分析仪可用于 DNA 测序分析，四种双脱氧核苷酸碱