通痹灵对佐剂性关节炎大鼠滑膜细胞产生IL-1、TNF-α及PGE2的影响

1、    通痹灵对佐剂性关节炎大鼠滑膜细胞产生 IL-1、TNF- 及 PGE2 的影响         摘要：为探讨中药复方制剂通痹灵(以桂枝芍药知母汤为基础)对佐剂性关节炎大鼠(AA)滑膜细胞分泌白细胞介素 1(IL-1)、肿瘤坏死因子 (TNF-)和前列腺素 E2(PGE2)的影响，采用大鼠膝关节滑膜细胞原代培养的方法，检测脂多糖(LPS)诱导关节滑膜细胞培养上清中 IL-1、TNF- 的活性和 PGE2 的含量。结果：AA 大鼠滑

2、膜细胞培养上清中 IL-1、TNF- 的活性和 PGE2 的含量高于正常组(P0.01)；通痹灵可使 AA 大鼠滑膜细胞异常升高的 IL-1、TNF- 和 PGE2 分泌功能恢复正常(与 AA 组比 P0.01，与正常组比 P0.05)；甲氨喋呤(MTX)也在一定程度上下调了滑膜细胞的分泌功能(与 AA 组比 P0.01，与正常组比 P0.05)；消炎痛对 PGE2 的产生具有明显的抑制作用(与 AA 组比 P0.01，与正常组比 P0.01)，但进一步上调了 AA 大鼠滑膜细胞分泌 IL-1、TNF- 的功能(与正常组比 P0.01)。结论：IL-1、TNF- 和 PGE2 在类风湿性关节炎

3、(RA)发病机理中占有重要地位；通痹灵对 RA 的治疗作用可能与其抑制滑膜细胞过度分泌细胞因子及炎症介质有关。主题词：通痹灵/药理学；关节炎，类风湿/中药疗法；通痹灵/治疗应用；桂枝芍药知母汤/药理学；关节炎，佐剂性/中药疗法；滑膜/分泌；白细胞介素 1；肿瘤坏死因子；前列腺素中分类号：R593.22文献标识码：A文章编号：1007-3213(1999)01-0017-04Effect of Tongbiling on Synoviocytes Secretion of IL-1,TNF- and PGE2in Rats with Adjuvant ArthritisCHEN Ji-fan，Z

4、HAO Hui-fang，SHEN Xiao-yan，LI Song-huaLI Ying-min，LIAO Shi-huang，HUANG Yang-mo(The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405,China)Abstract:To study the effects of Tongbiling (TBL) on synoviocytes secretion of IL-1,TNF- and PGE2 in rats with adjuvant arthritis (AA),I

5、L-1,TNF- bioactivity and PGE2 content of supernatant culture of synoviocytes induced by lipopolysaccharides were assayed by the methods of primary cultures of rat synoviocytes.The results showed that the bioactivity of IL-1 and TNF- and the content of PGE2 of supernatant culture of synoviocytes from

6、 AA rats increased more obviously than those from normal control group. The abnormal function of synoviocytes from AA rats was restored tonormal after the treatment with TBL. Methotrexate decreased the secretion of IL-1,TNF- and PGE2 to some extent. Indomethacin inhibited the production of PGE2 sign

7、ificantly while further promoted synoviocytes secretion of IL-1 and TNE-.It is concluded that IL-1,TNF- and PGE2 play an important role in the pathogenesis of rheumatoid arthritis (RA) and the mechanism of TBL for RA is probably related to the inhibition of the over secretion of cytokines and inflam

8、matory mediator by synoviocytes.Key words: TONGBILING/pharmacol.;ARTHRITIS,RHEUMATOID/TCD ther.;TONGBILING/ther.use;GUIZHI SHAOYAO ZHIMU DECOCTION/pharmacol.;ARTHRITIS,RHEUMATOID/TCD ther.;SYNOVIAL MEMBRANE/secretion;INTERLEUKIN-1;TUMOR?NECROSIS?FACTOR;PROSTAGLANDINS类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是

9、一种以关节滑膜慢性炎症、软骨吸收、骨质破坏和骨纤维化为特征的慢性自身免疫功能障碍性疾病。其关节损伤的病理过程与滑膜细胞、软骨细胞、巨噬细胞等产生的白细胞介素 1(IL-1)、肿瘤坏死因子 (TNF-)、白细胞介素 6(IL-6)等多种细胞因子密切相关1，2。其中 IL-1、TNF- 是关节软骨破坏的最重要的炎症介质，是 RA 发病机理中居中心地位的促炎症细胞因子3，4。中药复方制剂通痹灵是以经方桂枝芍药知母汤为基础研制而成。前文57报道了通痹灵具有抗炎和免疫调节作用。本文采用佐剂性关节炎(AA)大鼠滑膜细胞原代培养的方法，观察通痹灵对滑膜细胞产生 IL-1、TNF- 和前列腺素 E2(PGE2

10、)的影响，进一步研究通痹灵抗 RA 的可能作用机理。1材料与方法1.1药品与试剂通痹灵由本校第一附属医院制剂室生产，每片 0.25g；消炎痛(indomethacin,IM)，上海第十二制药厂产品；甲氨喋呤(methotrexate,MTX)，广州石歧制药厂产品；完全佛氏佐剂，日本三光株式会社产品；脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、刀豆球蛋白 A(ConA)以及放线菌素 D(actinomycin D)均为 Sigma 公司产品；溴化 3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基-2H-四氮唑3-(4，5-dimethylthiazol-2-y1)2，5-diphen

11、yl-2H-tetrazolium bromide,MTT，Fluka AG 产品； 型胶原酶(collagenase type ，440U/mg)，Sigma 产品；胰蛋白酶(1250)，Difco 产品进口分装；上述二种试剂均用 D-Hank's 缓冲液配制；3H前列腺素 E2(PGE2)放免药盒，比放射性为 5.92 TBq/mol，中国医学科学院基础所药理室提供；RPMI 1640 培养粉与 DMEM(Dubecco's modified Eagle's medium)培养粉均为 Gibco 公司产品；应用液另加 25 mmol/L Hepes、1 mmol/L

12、 丙酮酸钠、 2 mmol/L L-谷氨酰胺、 50 mol/L 二巯基乙醇、 100 kU/L 青霉素、100 mg/L 链霉素和 10% 小牛血清，pH 调整至 7.20。1.2动物及细胞株清洁级 Sprague-Dawley 大鼠，23 月龄，体重(180±20)g；C57BL/6，46 周龄，体重(18±2)g，中山医科大学实验动物中心提供。L929细胞株(小鼠纤维瘤细胞)购于第一军医大学附属珠江医院血液科，在含有 10%小牛血清的 RPMI 1640 培养液中传代培养。1.3仪器CO2培养箱， HWO301T-VBA 型，美国 HARRIS 产品；离心机，LDZ4

13、-OB 型，上海医用离心机厂；酶联免疫检测仪， 3550型，美国 BIO-RAD 产品。1.4动物分组及模型复制SD 大鼠 30 只随机分为通痹灵组、甲氨喋呤组、消炎痛组、空白模型组、正常组 5 组，每组用完全佛氏佐剂于每鼠右后肢足跖皮内注射 0.1mL (正常组免注射)复制 AA 模型。造模第 4 周开始灌胃，通痹灵组和消炎痛组分别按 5 g/(kg.d)、2 mg/(kg.d) 灌胃给药，甲氨喋呤组按 1.5 mg/(kg.w)灌胃给药。模型组和正常组按 10 mL/(kg.d) 用生理盐水灌胃。于实验第 16 周断头处死动物，分离关节滑膜。1.5滑膜细胞的分离和培养参照文献8，无菌条件下

14、分离大鼠膝关节滑膜，用 D-Hank's 液冲洗 3 遍，剪成约 12 mm3 小块，离心去除脂肪组织，经 0.2% 的胶原酶、 0.25%的 胰酶消化形成单个细胞，经 Giemsa 染色和台盼蓝染色，检测其纯度大于 98%、活力大于 95%，用含有 4 g/L LPS 的 DMEM 培养液配制滑膜细胞悬液 (5×105)加入 24 孔平底培养板内，每孔 1 mL，置于 37、5%CO2 培养箱内培养 48 h，收集上清，离心 (1200 r/min,10 min) ，0.22m 微孔滤膜过滤，-40 保存待测 IL-1、TNF- 活性。1.6IL-1纯度、活性检测1.6.1

15、纯度检测采用活化的小鼠脾细胞检测9。1.6.2活性检测采用 C57BL/6 雌性小鼠胸腺细胞增殖法，参照文献10进行。用 10% RPMI1640 培养液将胸腺细胞数调至 1×107 个，将含亚适量 ConA (终浓度为 4 mg/L) 胸腺细胞混悬液和不同稀释度待测上清液各 100 L 加到 96 孔平底培养板，并设空白对照(只含胸腺细胞)及 ConA 对照(ConA+胸腺细胞)。置5%、37 培养箱中培养 66 h，加入 MTT(5g/L) 溶液 20 L/孔，继续培养 6 h ，离心(2 000 r/min)10 min，弃上清，加二甲基亚砜溶液 150 L，振荡 3 min，

16、测 D 值(前称 OD 值，波长为 490 nm)，以 3 个复孔的 D 均值表示结果。1.7TNF-活性检测采用L929 细胞杀伤法。参照文献11 进行。计算杀伤百分率=(1-实验组 D 值/对照组 D 值)×100%。以 50% 杀伤率的最大稀释倍数为 1 kU/L。1.8前列腺素 E2(PGE2) 的免疫测定采用放射免疫法 (RTA) 12。1.9统计学处理测定值以(<"0201 (143 bytes)" src="/med/cano/201003/20100323184238426" 37 17>)表示，显著性检验用 t 检

17、验。2结果2.1IL-1 纯度检测 ConA 活化的小鼠脾细胞对 ConA、LPS 及 IL-1 待测上清均不起增殖反应，而对含 IL-2 的大鼠脾细胞与 ConA 共同培养收集的上清起增殖反应，表明待测上清中无明显 IL-2 污染。2.2通痹灵对 AA 大鼠滑膜细胞分泌 IL-1 的影响将待测滑膜细胞培养上清作15、1101160 稀释检测 IL-1 活性，以最佳稀释度 D 值表示。表 1 结果表明，AA 大鼠滑膜细胞分泌 IL-1 高于正常对照组(P0.01)，通痹灵可以抑制 AA 大鼠滑膜细胞过度分泌 IL-1，使之分泌功能恢复正常；甲氨喋呤对 AA 大鼠滑膜细胞的分泌 IL-1 也有一

18、定的下调作用，但作用不如通痹灵强；消炎痛则进一步增强了 IL-1 的分泌。2.3通痹灵对 AA 大鼠滑膜细胞产生 TNF- 的影响表1结果表明，AA 大鼠滑膜细胞产生 TNF- 高于正常对照组 (P0.01)；通痹灵治疗使 AA 大鼠滑膜细胞产生 TNF- 恢复正常；甲氨喋呤亦可降低 TNF-的产生，但作用不如通痹灵明显；消炎痛则促进了 AA 大鼠滑膜细胞产生 TNF-。2.4通痹灵对 AA 大鼠滑膜细胞产生 PGE2 的影响表1结果表明，AA 大鼠滑膜细胞产生 PGE2 高于正常组；通痹灵、甲氨喋呤、消炎痛均可以降低 AA 大鼠滑膜细胞产生 PGE2，但消炎痛的作用尤其明显。3讨论RA 是免

19、疫介导的炎症性疾病，细胞因子网络失调与 RA 发病及病程进展关系密切。其中 IL-1 和 TNF- 起着主导作用，在 RA 病变的早期可协助炎症细胞迁徙和增强内皮细胞粘附分子的表达，促进滑膜细胞增殖和滑膜微血管的新生，形成 RA 特征性血管翳；刺激滑膜细胞和中性粒细胞产生前列腺素等炎性介质；刺激软骨细胞和破骨细胞减少糖蛋白合成、增加糖蛋白降解。并产生胶原酶及其他中性蛋白酶，释放骨钙，导致软骨基质崩解，软骨吸收和骨破坏4。国内外的研究证实 RA 患者外周血、关节滑液及滑膜细胞培养上清中 IL-1 和TNF- 活性明显增高1，3，10，11。本实验采用滑膜细胞原代培养的方 法，检测培养上清中 IL

20、-1、TNF- 的活性和 PGE2 的含量，力从细胞因子角度研究 RA 的病理机制。结果表明，AA 大鼠滑膜细胞培养上清中 IL-1、TNF- 和 PGE2 活性均增高，与文献相符。通痹灵是以经方桂枝芍药知母汤为基础研制而成，由桂枝、芍药、知母、生姜、甘草、麻黄、白术、防风、川乌、水牛角、乳香、没药、马钱子、蜈蚣、玉竹等 15 味中药组成，具有清热除湿、滋阴通阳、活血通络、化瘀止痛的功效。以往的研究表明57，通痹灵无毒副作用，抗炎镇痛作用好，有降低抗胶原抗体效价，抑制关节骨质破坏，调节淋巴细胞功能等功效。本实验结果表明，通痹灵降低 AA 大鼠滑膜细胞培养上清中 IL-1、TNF- 的活性和 P

21、GE2 含量，使高调节的滑膜细胞分泌能力恢复正常，提示通痹灵对 RA 的治疗作用与其抑制滑膜细胞过度分泌细胞因子及炎症介质有关。表1不同滑膜细胞培养上清中 IL-1、INF-的活性和PGE2的含量(<"0201 (143 bytes)" src="/med/cano/201003/20100323184238426" 37 17>)组别N/只DIL-1JTNF-/(U.mL-1)PGE2/(g.L-1)正常组60.343±0.02742.5±3.72.6±0.3模型组60.640±0.038*65.4&

22、#177;4.8*4.0±0.3*通痹灵组60.357±0.032#44.3±3.5#2.7±0.2#甲氨喋呤组60.442±0.041*#51.6±3.1*#3.2±0.4*#消炎痛组60.761±0.057*#78.1±6.2*#1.9±0.2*#     *与正常组相比P0.05，*P0.01；#与模型组相比P0.05，#P0.01 甲氨喋呤具有免疫抑制和抗炎作用，是目前常用的治疗 RA 的药物。本实验结果表明甲氨喋呤在一定程度上抑制了 IL-1、T

23、NF- 和PGE2 分泌，下调了滑膜细胞升高的分泌能力，但作用较通痹灵弱，而且毒副作用大；而消炎痛虽然对 PGE2 的产生具有明显的抑制作用，但进一步增强了 AA 大鼠滑膜细胞分泌 IL-1 和 TNF- 的能力，这可能与局部的负反馈调节有关。实验中观察到通痹灵组大鼠的平均体重高于甲氨喋呤组和消炎痛组，而且其进食量、外观毛色及活动状态均优于甲氨喋呤组和消炎痛组。本项研究及我们以往的资料说明，中药复方制剂通痹灵不仅可以改善症状而且可以改变病情，其治疗 RA 的机理之一可能与其能使滑膜细胞异常升高的分泌能力恢复正常有关。通痹灵安全、无毒、耐受性较甲氨喋呤和消炎痛好，还可以改善 AA 大鼠的一般状况

24、，为一很有前途的治疗 RA 新药。其进一步的作用机理尚待研究。基金项目：广东省自然科学基金资助课题，编号 960550作者简介：陈纪藩，男，教授；作者单位：陈纪藩(广州中医药大学第一附属医院，广州510405）赵会芳（广州中医药大学第一附属医院，广州510405）沈晓燕（广州中医药大学第一附属医院，广州510405）李颂华（广州中医药大学第一附属医院，广州510405）李迎敏（广州中医药大学第一附属医院，广州510405）廖世煌（广州中医药大学第一附属医院，广州510405）黄仰模（广州中医药大学第一附属医院，广州510405）参考文献：1Molving J.Endotoxin-stimulated human monocyte secretion of interleukin-1,tumor necrosis factor alpha,and postaglandin E2 shows stable interindividual differences J. Scand J Immuno