间充质干细胞联合造血干细胞共移植治疗顽固性重型再生障碍性贫血2例疗效观察

1、间充质干细胞联合造血干细胞共移植治疗顽固性重型再生障碍性贫血2例疗效观察         11-01-05 15:41:00     编辑：studa20                  作者：马慧珍，李宁，宋永平，魏旭东，房佰俊【摘要】  目的 观察半相合间充质干细胞(mesenchymal s

2、tem cells, MSC)联合造血干细胞(hematopoietic stem cells, HSC)共移植治疗2例顽固性重型再生障碍性贫血患儿(severe aplastic anemia, SAA)的疗效。方法 分别对2例首次或2次移植后复发的顽固性SAA患儿行半相合脂肪源性间充质干细胞(adipose tissuederived mesenchymal stem cells, AMSC)联合同胞HLA全相合外周血造血干细胞共移植。结果 2例患儿均移植成功。两年来患儿状态良好，未给予其他任何治疗，无输血依赖性。结论 MSC与HSC共移植可能会提高造血干细胞移植治疗顽固性SAA的移植成功

3、率。 【关键词】  重型再生障碍性贫血;造血干细胞移植;植入失败;间充质干细胞在过去20年来，造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)治疗重型再生障碍性贫血(severe aplastic anemia, SAA)患者的疗效已经有了很大的提高1。但更多的回顾性资料显示,移植失败仍是严重威胁患者生命的并发症之一。在动物实验及人体实验中，已经证实间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)可促进造血干细胞(hematopoietic stem cells, HSC)的植入27。此外，大量的研究结

4、果提示，MSC可以改变淋巴细胞对异基因靶细胞的反应性，这种改变诱导异基因宿主体内形成持久的供者特异性免疫耐受，从而促使异基因皮肤移植成功89。另外，在动物及人体实验中，目前的研究结果已提示，自体或异基因MSC输注是安全的，且无急性和长期MSC相关不良反应1014。这些数据进一步证实了一个假说，即扩增培养的MSC和HSC共移植是安全的，可以促进HSC的植入，降低潜在的移植失败的发生率。本文简述了2例首次或2次移植后复发的顽固性SAA患儿在行第2次或第3次异基因HSCT时，采用半相合脂肪源性间充质干细胞(adipose tissuederived mesenchymal stem cells, A

5、MSC)联合HSC移植的治疗方案，初步评估了AMSC在异基因HSCT中的效果(促进HSC植入及降低移植失败率)。1 对象与方法1.1 成人脂肪源间充质干细胞的分离和扩增 在征得河南省肿瘤医院伦理委员会的同意及2位患者的母亲(HLA配型半相合)签署书面同意书后，AMSC的获取参照我们实验室已建立方法10：用2g/L的型胶原酶(美国Sigma公司)消化适量的来自供者腹部的皮下脂肪组织30min后，除去上层悬浮的成熟脂肪细胞和红细胞，离心(200g×10min)，再用70100m滤网连续过滤2遍，然后将细胞用含50mL/L人AB型血清的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2遍，以2×106

6、/L的浓度接种到培养瓶内。选择性扩增培养体系：DMEM/F12(英国Gibco公司)，40% MCDB201(美国Sigma公司)，50mL/L人AB型血清，1×胰岛素转铁蛋白硒(英国Gibco公司)，10-9mmol/L地塞米松(美国Sigma公司)，10-4mmol/L抗坏血酸2磷酸盐(美国Sigma公司)，10ng/mL上皮细胞生长因子(美国Sigma公司)，10ng/mL血小板源性生长因子(美国Sigma公司)，100u/mL青霉素(英国Gibco公司)，1000u/mL链霉素(英国Gibco公司)。当细胞贴壁达到70%时，用1.25g/L胰酶+0.1g/L乙二胺四乙酸(ED

7、TA)消化并且用同样的培养基扩增传代。扩增培养的细胞用流式细胞仪(美国BD公司)检测其免疫表型，得到的数据用Cellquest软件(美国BD公司)分析。扩增细胞表达血管内皮细胞生长因子受体2(Flk1)、CD166、CD105、CD44、CD29和HLAClass分子而不表达CD34、CD45、CD14和HLAClass分子10。病原学检测结果显示：扩增细胞在输注前无细菌、支原体及真菌感染。AMSC在外周血造血干细胞(PBSC)输注后4h内以1×106/kg的细胞数通过中心静脉输入。1.2 研究对象 病例1，女，11岁，诊断为SAA后6个月，于2002年8月接受其同胞兄长供者(HLA

8、全相合)的外周造血干细胞移植。移植前预处理：环磷酰胺(cyclophosphamide, Cy)每日50mg/kg×4d静滴，兔ATG(antithymocyte globulin，法国ImtixSangstat公司)每日2.5mg/kg×4d静滴。移植后移植物抗宿主病(graftversushost disease, GVHD)的预防：短程甲氨喋呤(methotrexate, MTX)加标准剂量环孢菌素A(cyclosporine A, CsA)。利用CliniMACS系统(德国Miltenyi Biotec公司)阳性分选去除CD3+ T细胞后，患者接受输注的单个核细胞数

9、为6.5×108/kg，其中CD34+细胞为5.07×106/kg，CD3+细胞为0.12×105/kg。移植后患者无明显GVHD表现，3月后摆脱输血依赖性，但于2004年7月患者出现全血细胞进行性减少情况，环孢菌素A及甲基强的松龙治疗均无效，重组人粒细胞集落刺激因子和促红细胞生成素也不能促进患者造血恢复。因此，在清髓性预处理情况下利用同一供者源外周造血干细胞进行2次移植。预处理：每日Cy 50mg/kg×4d静滴。移植后患者于2.5月后摆脱输血依赖性。2005年3月患者病情再次恶化，血细胞计数：中性粒细胞(absolute neutrophil cou

10、nt, ANC)0.14×109/L，血红蛋白(Hb)38g/L，血小板(PLT)8×109/L;骨髓活检提示骨髓空虚;细胞遗传学检测示骨髓细胞核型正常;血清溶血试验阴性。诊断为SAA第2次复发。病例2，男，12岁，2004年3月诊断为SAA。2004年9月来我院接受同胞全相合HSCT。移植前预处理：每日Cy 50mg/kg×4d静滴，兔ATG(法国ImtixSangstat公司)每日2.5mg/kg×4d静滴。GVHD预防：短程MTX加标准剂量CsA。在利用CliniMACS系统(德国Miltenyi Biotec公司)阳性分选去除CD3+T细胞后，患

11、者于2004年10月接受其HLA全相合同胞姐姐外周血造血干细胞移植，接受输注的单个核细胞数为6.9×108/kg，其中CD34+细胞：5.16×106/kg，CD3+细胞：0.1×105/kg。移植+32d，患者仍无明显造血植入表现，骨髓活检提示骨髓空虚，诊断为移植失败。1.3 挽救治疗方案 患者1于2005年8月接受来自其母亲的半相合AMSC和同一供者外周血造血干细胞共移植，预处理方案与第1次移植相同。在利用CliniMACS系统(德国Miltenyi Biotec公司)阳性分选去除CD3+ T细胞后，患者接受输注的单个核细胞数为4.8×108/kg，

12、其中CD34+细胞：4.41×106/kg，CD3+细胞：0.11×105/kg。在利用CliniMACS系统(德国Miltenyi Biotec公司)阳性分选去除CD3+ T细胞后，患者接受同一供者外周血造血干细胞与来自母亲的半相合AMSC共移植，输注的单个核细胞数6.5×108/kg，其中CD34+细胞：4.62×106/kg，CD3+细胞：0.11×105/kg，预处理方案和GVHD的预防与第1次移植相同。患者2于2005年2月接受间充质干细胞联合造血干细胞共移植治疗。在利用CliniMACS系统(德国Miltenyi Biotec公司)

13、阳性分选去除CD3+ T细胞后，患者接受同一供者外周血造血干细胞与来自母亲的半相合AMSC共移植，输注的单个核细胞数6.5×108/kg，其中CD34+细胞：4.62×106/kg，CD3+细胞：0.12×105/kg，预处理方案和GVHD的预防与第1次移植相同。     11-01-05 15:41:00     编辑：studa202 结 果患者1接受间充质干细胞联合造血干细胞共移植治疗后+16d，血细胞计数显示ANC达0.6×109/L。联合移植后+20d血小板开始上升

14、。联合移植后+25d供受者嵌合状况检测结果显示：供者CD3、CD19、CD33达到完全嵌合。移植后+44d患者无任何并发症出院。现已无病生存32个月。患者2接受间充质干细胞联合造血干细胞共移植治疗后+15d，血细胞计数显示ANC为0.6×109/L。移植后+19d，血细胞计数显示PLT为2.0×109/L。移植后+23d，供受者嵌合状况检测结果显示：供者CD3、CD19、CD33达到完全嵌合。移植后两个月，患者发生度皮肤型急性GVHD，对糖皮质激素甲基强的松龙敏感。10d后，皮疹基本消失，激素减量至停用。移植+89d患者出院。移植2年后，患者造血功能仍正常。3 讨 论MSC

15、可以来源于成人骨髓、脂肪和多种胚胎组织。体外实验结果显示，MSC具有免疫逃逸特性，同时也具有免疫调节作用。在异基因造血干细胞移植中，一方面，MSC可用于促进造血重建，预防GVHD的发生及治疗严重的急性GVHD11,1415。另一方面，应当注意成人MSC具有向恶性细胞转化的趋势。BERNARDO等16最近观察到人MSC在体外不同培养时相易向不同的组织细胞分化,在MSC延时培养前后，通过采用阵列比较基因组杂交技术(arrayCGH)、常规的染色体检测技术以及荧光原位杂交技术等，对MSC的遗传学特性进行了深入研究，结果显示，体外扩增中的MSC增殖潜能的减低与其衰老进程是同步的，同时其端粒长度在逐步缩

16、短，但在此过程中并无染色体畸变出现。这些结果提示，扩增后的MSC在机体内不会有恶变的可能。此外，大量的文献报道提示，接受MSC输注的患者并无急性毒性及长期MSC相关不良反应发生，相反却明显提示MSC可显著提高HSC的植入，提高HSCT的成功率1215,17。在我们的初步研究中，2例移植失败的患者，接受共移植后，在1个月内CD3、CD19、CD33均达到完全嵌合状态。移植2年后，造血功能正常，并未给予任何其他治疗，患者完全进入非输血依赖状态。这些结果提示，MSC可促进HSC的植入并可能阻止移植失败的发生。另一方面，在MSC促进HSC快速植入的同时，两例患者均未发生严重的急性GVHD，这就提示，A

17、MSC在体内可能也具有显著的免疫调节作用，可预防和阻止GVHD的发生。总之，我们的初步研究结果显示：对顽固性SAA患儿，在其首次或2次移植失败后，半相合AMSC联合HSC共移植是可行和安全的，共移植的MSC可调节宿主同种异体细胞的反应性并促进供者HSC的植入，降低移植失败的发生。但这些结果有待于积累更多的临床资料加以证实。【参考文献】  1BACIGALUPO A, BRAND R, ONETO R, et al. Treatment of acquired severe aplastic anemia: bone marrow transplantation compared wi

18、th immunosuppressive therapyThe European Group for Blood and Marrow Transplantation experience J. Semin Hematol, 2000, 37(1):6980.2NOORT WA, KRUISSELBRINK AB, INT ANKER PS, et al. Mesenchymal stem cells promote engraftment of human umbilical cord bloodderived CD34(+) cells in NOD/SCID mice J. Exp He

19、matol, 2002, 30(8):870878.3INT ANKER PS, NOORT WA, KRUISSELBRINK AB, et al. Nonexpanded primary lung and bone marrowderived mesenchymal cells promote the engraftment of umbilical cord bloodderived CD34(+) cells in NOD/SCID mice J. Exp Hematol, 2003, 31(10):881889.4ALMEIDAPORADA G, Flake AW, Glimp HA

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21、eexpanded marrow mesenchymal stem cells in advanced breast cancer patients receiving highdose chemotherapy J. J Clin Oncol, 2000, 18(2):307316.6BALL LM, BERNARDO ME, ROELOFS H, et al. Cotransplantation of ex vivo expanded mesenchymal stem cells accelerates lymphocyte recovery and may reduce the risk of graft failure in haploidentical hematopoietic stemcell transplantation J. Blood, 2007, 110(7):27642767.7LE BLANC K, SAMUELSSON H, GUSTAFSSON B, et al