雷公藤内酯醇对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞IL18及其受体表达的影响

1、雷公藤内酯醇对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞IL18及其受体表达的影响         11-01-28 13:18:00     编辑：studa20                     作者：毛晓丹, 孙赛君, 裴紫燕, 张立煌【摘要】  目的: 研究雷公藤内酯醇(

2、TP)对佛波酯(PMA)刺激的关节滑膜成纤维细胞(RASF) 白细胞介素18(IL18)及其受体（IL18R）表达的影响, 并对其机制进行探讨。方法: RASF先用TP(0100 g/L) 预处理2 h, 再用PMA (50 g/L)刺激。收集上清用 ELISA 法检测上清IL18水平。利用人IL18能特异诱导人髓系单核细胞KG1产生IFN的特性检测上清中IL18生物学活性。收集处理的RASF, 用Western blot 和荧光定量RTPCR检测IL18和IL18R的蛋白和mRNA表达。NFB的活性用类ELISA法检测。 结果: TP能有效抑制PMA刺激的RASF的IL18生物学活性。TP能

3、够抑制PMA刺激的RASF的IL18和IL18R的蛋白和mRNA表达。TP还抑制PMA刺激的RASF 的NFB 活性。TP对PMA刺激的RASF 的抑制效应呈剂量相关性。结论: TP能有效抑制PMA刺激的RASF 的IL18和IL18R的表达。这些结果说明了TP对RA治疗作用的机制。 【关键词】  雷公藤内酯醇; 类风湿关节炎; IL18; IL18R    Abstract  AIM:  To determine the effects of triptolide (TP) on the expression of interleu

4、kin18 (IL18) and its receptor in phorbol 12myristate 13acetate (PMA)stimulated rheumatoid arthritis synovial fibroblasts (RASF). METHODS:   RASF were pretreated with TP (0-100 g/L) for 2 h before stimulation with PMA (50 g/L). The bioactivity of IL18 in the supernatant was detected based o

5、n IFN secretion from IL18responding human myelomonocytic KG1 cells. IL18 level was analyzed by ELISA. To estimate the protein and mRNA expression of IL18 and IL18R in RASF,  Western blot and quantitative RTPCR were performed. Nuclear factorB (NFB) activity in the wholecell extract of treated RA

6、SF was also measured using an ELISAbased method. RESULTS:   TP effectively inhibited the bioactivity of IL18 in PMAstimulated RASF. The expression of IL18 and IL18R at protein and gene levels was reduced by TP. NFB activity in PMAstimulated RASF was profoundly suppressed by TP. These effec

7、ts showed a high correlation with TP concentration (0-100 g/L). CONCLUSION:  TP effectively inhibited the expression of IL18 and its receptor in PMAstimulated RASF. These results suggest a mechanism of TP in RA therapy.    Keywordstriptolide;  rheumatoid arthritis;  int

8、erleukin18;  interleukin18 receptor类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一个自身免疫性疾病, 主要表现为滑膜成纤维细胞的大量增生和炎性细胞浸润的多关节滑膜组织的慢性炎症。RA患者关节滑膜组织过度表达IL18、 TNF、 IL1等炎症细胞因子1, 进而激活关节滑膜成纤维细胞NFkB的活性, 促进COX2、 iNOS的大量表达, 迅速大量合成PGE2、 NO, 导致关节滑膜炎症、 肿胀、 增生、 滑膜血管翳大量生成, 最终导致关节退变, 此为RA重要的发病机制之一2。IL18在RA发生发展中起到重要作用3, 下调IL18的活

9、性是治疗RA的一个潜在策略。    雷公藤为中国传统中药, 具有明显的抗炎、 抗风湿及免疫抑制作用4。雷公藤内酯醇（Triptolide, TP）是中药雷公藤的有效单体成分5, 其抗RA机制主要为抑制机体的免疫反应, 下调Th1类细胞及细胞因子的活性, 进而抑制炎症因子及炎症介质的表达。随着细胞及分子生物学研究的深入, TP抗炎及抗RA的分子机制也得到进一步的认识。我们研究TP对PMA刺激的RASF IL18及其受体（IL18R）表达的影响, 并对其机制进行探讨, 为TP抗RA治疗提供新的理论和实验依据。    1  材料和

10、方法    1.1  类风湿关节滑膜成纤维细胞（RASF）的分离和培养  关节滑膜组织取材于浙江大学医学院附属医院骨科, 行膝关节置换或滑膜切除术的5例类风湿性关节炎患者, 均符合1987年美国风湿病协会修订的类风湿关节炎诊断标准。无菌条件下剪碎滑膜组织, 用含4.0 g/L胶原酶（Sigma）的RPMI1640培养液（Gibco）, 于37、  50 mL/L CO2培养箱孵育消化4 h, 离心收集细胞, 加含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液, 于37、 50 mL/L CO2孵育箱中培养, 使细胞贴壁。弃除未贴壁的

11、细胞, 继续培养18 h, 贴壁细胞用DHanks彻底冲洗后, 用含2.5 g/L胰酶的消化液（Gibco）消化收集贴壁的滑膜成纤维细胞传代培养。经34次传代后, 用流式细胞术鉴定细胞纯度达98%以上CD3、 CD20、 CD68、 Von Willibrand factor (第8因子相关抗原)阳性细胞1%。    1.2  实验分组及滑膜成纤维细胞的处理  将滑膜成纤维细胞1×106/孔接种于6孔板（Falcon）中, 待细胞完全贴壁后弃上清, 用含不同浓度雷公藤内酯醇（TP, 0100 g/L）的培养液预处理2 h, 然后加佛波

12、酯（PMA, 50 g/L, Sigma）刺激, 继续培养18 h。收集各组细胞培养上清液及细胞, 备检。    1.3  IL18的生物活性检测  利用人IL18能特异诱导人髓系单核细胞KG1（引自美国ATCC, CCL246, 由本所常规传代保存）产生IFN的特性, 通过ELISA法检测培养上清液IFN的水平（hIFN ELISA Kit, 美国R&D Systems）, 结果以IFN浓度反映被测样品中IL18的生物活性。按Yamamura等6方法操作。所有检测样品均用鼠抗人IL18单克隆抗体（D0443, 美国R&D Sy

13、stems）中和后作对照（抗体终浓度2 mg/L, 37作用1 h）, 以示其特异性。    1.4  双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）检测  采用ELISA法, 检测培养上清液IL18（hIL18 ELISA Kit,  MBL Japan）的水平。操作严格按说明进行。最后于全自动酶标仪（BioTek Elx800, 美国）读取A450值, 根据标准反应曲线求得样品IL18的水平。    1.5  细胞蛋白提取及Western blot检测  收集细胞, 加细胞裂解液Lysi

14、s Buffer,  20 mmol/L TrisHCl (pH7.5),  150 mmol/L NaCl,  1 mmol/L Na2EDTA,  1 mmol/L EGTA,  10 mL/L Triton,  10 mL/L NP40,  2.5 mmol/L Sodium pyrophosphate,  1 mmol/L glycerophosphate,  1 mmol/L  Leupeptin,  1 mmol/L PMSF, 冰浴30 min后于10 000 r/min

15、离心3 min, 收集离心上清液, 于蛋白分析仪（Beckman DU640）上测定各样品蛋白含量（Bradford比色法, 美国Pierce公司）。取40  g蛋白样品加上样缓冲液煮沸变性后, 进行100 g/L SDSPAGE, 并转移至硝酸纤维素膜（0.45 m, ImmobilonP, Millipore）, 于封闭液（含50 g/L脱脂奶粉, 20 g/L BSA, 0.5 mL/L Tween20的PBS）室温封闭2 h, 分别加入抗人IL18、 抗人IL18R（1500,  R&D System）或抗人Actin抗体（12 000,  San

16、ta Cruz）, 于杂交炉（Hybaid）中室温滚动反应2 h; 洗膜5 min×3次, 加相应的辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗(15 000,  Santa Cruz), 室温反应2 h; 充分洗膜后作ECL化学发光（SuperSignal West Dura Kit,  Pierce）, X片（Kodak）曝光显影。    1.6  荧光定量RTPCR检测  收集各组滑膜细胞, 用TRIzol（美国Gibco公司）常规提取总RNA, 溶于50 L DEPC处理水, 经核酸蛋白紫外分析仪（Beckman D

17、U640）检测, 260/280比值为1.751.80。取1 g总RNA于42逆转录（SuperScript II Reverse Transcriptase, Invitrogen）50 min后, 以肌动蛋白（actin）作为内对照, 进行荧光定量PCR（LightCycler FastStart SYBR Green I Master, Roche）检测IL18及IL18R mRNA表达水平。IL18引物（扩增产物480 bp）上游: 5TTC GGG AAG AGG AAA GGA AC3, 下游: 5AAG GAT ACA AAA AGT GAC AT3; IL18R引物（扩增产物4

18、19 bp）上游: 5CCC AAC GAT AAA GAA GAA CGC C3, 下游: 5TGT CTG TGC CTC CCG TGC TGG C3; actin引物（扩增产物619 bp）上游: 5CGC TGC GCT GGT CGT CGA CA3, 下游: 5GTC ACG CAC GAT TTC CCG CT3。每个LightCycler PCR（15 L）反应体系为: 1.5 L LightCycler FastStart DNA Master Mix, 1.8 L MgCl2（25 mmol/L）, 0.4 L of each primer（10 mol/L）, 2 L经10倍稀释的cDNA, 9.3 L H2O。PCR程序为95预变性10 min; 94变性10 s, 65复性15 s, 72延伸15 s, 扩增50个循环; PCR产物95变性1 min后迅速降温至55维持30 s, 缓慢升温（0.1  steps）至95, 收集荧光信号, 熔解曲线分析。结果以目的基因与相应的actin比值表示。反应结束后, 取5 L PCR产物作琼脂糖凝胶（15 g/L）电泳检测。    1.7  NFB p65活性检测  用NFB p65转录因子试剂盒(Acti