钴原卟啉对H9c2心肌细胞缺氧_复氧损伤的保护作用_图文

1、352中国药理学通报Chinese Phar m acological B ulletin 2009Mar; 25(3 :3526钴原卟啉对H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用朱晓洁, 梁飞, 王秀宏, 赵炜明, 高旭(哈尔滨医科大学生物化学与分子生物学教研室, 黑龙江哈尔滨150086中国图书分类号:R 2332; R 322111; R 32912; R 342122;R 345141; R 54212; R 845122; R 97713心肌缺血/再灌注是一个重要的临床问题, 而临床上对心肌缺血/再灌注的防治尚缺乏有效的方法。因此, 心肌缺血/1(HO 21 是, 可将血红素分解素H

2、O 1是一种热休克蛋白(, , 低氧, H 2O 2, 紫外线照射等。近年人们发现HO 21在有害刺激和疾病条件下对机体具有保护作用, 特别是诱导HO 21过表达在抗缺血/再灌注方面具有很好的功效25文献标识码:A 文章编号:1001-1978(2009 03-0352-05摘要:目的研究钴原卟啉(C OPP 预处理在H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤中的作用及分子机制。方法建立H9C2心肌细胞缺氧/复氧模型。在H9c2心肌细胞缺氧/复氧前用COPP 预处理, 并用锌原卟啉(Znpp 视(AT AR 分别抑制HO 21LDH 、CK 2mRNA 表达水平;W estern bl ot 21、N r

3、f2的蛋白表达水平。结果与缺氧/复氧组比, C OPP 预处理组中LDH 和CK 水平均明显降低, 而HO 21mRNA 水平, 蛋白水平及细胞核的N rf2蛋白水平均明显增加; Znpp 的加入阻断了C OPP 预处理对心肌细胞的保护作用; AT AR 的加入抑制了N rf2在细胞核的聚集, 进而抑制了C OPP 对HO 21的诱导。结论COPP 预处理诱导H9c2心肌细胞HO 21过表达, 具有抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用; 其机制与N rf22ARE 信号通路相关。关键词:血红素加氧酶21; 钴原卟啉; 缺氧/复氧; N rf22ARE收稿日期:2008-11-05, 修回日期:2

4、008-12-28基金项目:黑龙江省自然科学基金资助项目(No D2006209 ; 黑龙江省博士后启动基金; 哈尔滨医科大学医学基础学科青年科学基金资助项目作者简介:朱晓洁(1982- , 女, 硕士生, 研究方向:血红素代谢及相关疾病, Tel:0451286671684, E 2mail:zhuxiaojie0070hot m ail . com;。COPP 是至今发现的金属卟啉类的最有效的HO 21诱导剂, 而且在细胞内不会分解代谢生成活性氧族, 不会增加氧化应激6。因此, COPP 是诱导HO 21过表达的理想药物。在H9c2心肌细胞中, COPP 对心肌细胞缺血/再灌注损伤的影响及

5、其机制, 目前国内外尚未见报道。本实验通过模拟体内心肌缺血/再灌注, 研究探讨COPP 在体外培养的心肌细胞缺氧/复氧损伤中的作用及其分子学机制, 有望为心肌缺血/再灌注损伤的治疗提供一个新的思路。1材料与方法1. 1实验细胞株H9c2大鼠心肌细胞株购自上海生命科学研究院细胞库。1. 2主要试剂RT 2PCR 试剂盒和TR I z ol (I nvitr o 2gen , 乳酸脱氢酶(LDH 和肌酸激酶(CK 试剂盒(南京建成生物工程研究所 , HO 21一抗(Santaruz C , N rf2一抗(ABca m , 2actin 一抗和辣根过氧化e modin under hypoxic

6、conditi on . Conclusi on I n the hypoxic envir onment, e modin combined with radi other 2apy can effectively inhibit the exp ressi on of H I F 21and DNA double 2strand break repair genes (K U70/K U80 , which may be its mechanis m of radi osensitiza 2ti on .Key words:e modin; hypoxia; repair gene; re

7、al 2ti m e fluorescence quantitative RT 2PCR; nas opharyngeal car 2cinoma王秀宏(1970- , 女, 副教授, 硕士生导师, 研究方向:血红素代谢及相关疾病, 通讯作者, Tel:0451286671684, E 2mail:wangxh700417yahoo . com. cngr oup s and the contr ol gr oup under hypoxic conditi on was detected by the real 2ti m e fluorescence quantitativewas sig

8、nifi 2RT 2PCR. Results Exp ressi on of H I F 21had cantly increased under hypoxia conditi on . H I F 21no change after treat m ent with e modin al one . The ex 2p ressi on level of K U70/KU80was induced by radia 2ti on . Compared with radiati on al one gr oup, radiati on combined hypoxia gr oup obvi

9、 ously enhanced the ex 2p ressi on of K U70/KU80. K U70/K U80mRNA exp res 2si on significantly reduced after radiati on combined with中国药理学通报Chinese Phar m acological B ulletin 2009Mar; 25(3 353物酶标记的二抗(北京中杉金桥 , ECL p lus 和细胞核-胞质蛋白提取试剂盒(北京普利莱生物制品有限公司 , COPP 和ATRA (Sig ma , Znpp (I nterna 2ti onal Labo

10、rat ory , BCA 蛋白定量试剂盒(杭州碧云天生物技术有限公司 , 其他试剂均为国产分析纯。1. 3H9c2心肌细胞的培养和实验分组H9c2细抗浓度为14000, 37孵育1h, X 线片曝光, 显影。实验结果使用B I O RAD GS 2800系统扫描, 并定量分析X 线片条带的光密度。实验重复3次。1. 7H9c2心肌细胞细胞核Nrf2蛋白表达水平的检测生长良好的心肌细胞施加因素后去除培养液, 按细胞核-胞质蛋白提取试剂盒说明提取细胞核中的N rf2蛋白。用BCA 试剂盒进行蛋白定量。取50g 蛋白于12%S DS 2P AGE 分离蛋白质, 转印至P VDF 膜, 封闭后加入1

11、1000一抗(2actin, N rf2 , 37孵育1h, 14000, 37, B I O 22X 线片条带的3次。1. 8统计学处理实验数据用珋x s 表示, 统计学处理使用SPSS 1210统计软件, 采用方差分析方法判断其差异显著性。2结果2. 1CO PP 预处理对HO 21m RNA 和蛋白表达水平的影响对照组HO 21mRNA 和蛋白表达水平很低, 缺氧/复氧组的HO 21mRNA 和蛋白表达水平胞株在含10%胎牛血清高糖DME M 完全培养基中培养(条件为37, 5%CO 2 , 23d 传代1次。实验时取对数生长期细胞, 将细胞随机分成5组:对照组:正常培养细胞不做任何处理

12、; 缺氧/复氧组:加入饱和氮气pH 618D 2Hanks 液培养细胞2h, 再用DME M 完全培养基培养细胞6h 。-1处理组:用含10mol L 养基预处理细, COPP /复氧-1处理; COPP +组:用含10mol L COPP-1和20mol L Znpp 的DME M 完全培养基预处理细胞12h (除检测HO 21mRNA 时, COPP 和Znpp 预处理细胞时间为4h , 然后进行缺氧/复氧处理; -1COPP +AT RA 组:用含10mol L COPP 和1mol L -1AT RA 的DME M 完全培养基预处理细胞12h, 然后进行缺氧/复氧处理。1. 4生化指标

13、的测定按照试剂盒说明书, 测定心肌细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH 和肌酸激酶(CK 活力水平。1. 5RT 2PCR 检测HO 21m RNA 表达用TR I z ol试剂提取总RNA, 紫外分光光度计测量RNA 样品的纯度, OD 260/280值大于117的样品按两步法RT 2PCR 试剂盒说明进行逆转录和PCR 操作。其中HO 21引物:上游5GCT CT ATCGTGCT CGCATG A 下游5AATT CCCACTGCCA 2CGGTC 3, 扩增DNA 片段大小为319bp; 2actin 引物:上游5CCCT AAGGC 2CAACCGTG AA 3, 下游5CCGCT CAT

14、TGCCG AT 2AGTG A 3, 扩增DNA 片段大小为430bp; PCR 条件为:94预变性2m in, 94变性30s, 56退火30s, 72延伸30s, 共进行30个循环, 最后再72延伸10m in 。PCR 产物以112%琼脂糖凝胶电泳分离鉴定, 紫外凝胶成像系统进行半定量分析。1. 6W estern blot 检测心肌细胞HO 21蛋白表达水平收集各组细胞, 用P BS 洗涤3次, 加入含有P MSF 的细胞裂解液, 冰上作用30m in, 4, 12000r m in 离心15m in, 取上清进行蛋白质定量, 取50g 总蛋白样品于12%变性聚丙烯酰胺凝胶电-1F

15、i g 1Expressi on of HO 21m RNA i n H9c2m yocytes of d i fferen t groups and the i r result ana lysis (珋x s, n =3M:Marker; 1:Contr ol gr oup; 2:Hypoxia /reoxygenati on gr oup; 3:COPP p retreat m ent gr oup; 4:COPP +Znpp gr oup.3P 0105vs contr olgr oup; P 0105, P 0101vs hypoxia /reoxygenati on gr oup.

16、 I ntensi 2ty of each band was quantified by densit ometry, and data were nor malized by using the actin signal . Contr ol gr oup was detected as a basal level (designated as 1 , and the others were exp ressed as folds compared with contr ol .泳, 随后转印至P VDF 膜, 用5%脱脂奶粉封闭后加入11000一抗(2actin, HO 21 37孵育11

17、5h, 二354中国药理学通报Chinese Phar m acological B ulletin 2009Mar; 25(3较对照组略有增加(P 0105 ; 而COPP 处理组的HO 21mRNA 和蛋白表达水平较缺氧/复氧组有明显2. 3CO PP 预处理对H9c2心肌细胞胞核中Nrf2蛋白表达水平的影响与正常组比, 缺氧/复氧组和COPP 预处理组心肌细胞胞核中的N rf2蛋白水平均增加(P 0101 。Znpp 的加入抑制了COPP 对HO 21mRNA 和蛋白表达水平的诱导。结果见Fig 1和Fig 2。2. 2CO PP 预处理对H9c2心肌细胞LD H 及CK增高, 其中以C

18、OPP 预处理组增加的最明显。AT RA 的加入抑制心肌细胞中N rf2在细胞核的聚集。结果见Fig 3。水平的影响缺氧/复氧组的LDH 和CK 活力水平较对照组明显升高(P 0101 , COPP 处理组的LDH 和CK 水平较缺氧/复氧组有明显下降(P 0101 。COPP +Znpp 组的LDH 和CK 水平与缺氧/复氧组相接近(P 0105 。结果见Tab 1。Tab 1The level of LD H and CK i m d i t (n =3Gr oup Contr olHypoxia /reoxygenati on COPP p retreat m ent COPP +Znp

19、p/U-100151. 242081. 35307. 4533CK /UL -1318. 25128. 94906. 75206. 3733964. 41209. 601990. 37337. 84514. 11162. 58865. 12211. 9233P 0101vs contr ol;P 0105, P 0101vs hypoxia /reoxy 2genati on .F i g 3Expressi on of nuclear Nrf2prote i n i n the nucleus of H9c2m yocytes of d i fferen t groups and the i

20、 rresult ana lysis (珋x s, n =31:contr ol gr oup; 2:hypoxia /reoxygenati on gr oup; 3:COPP p retreat 2ment gr oup; 4:COPP +ATRAgr oup.3P 0105vs contr ol gr oup,P 0105vs hypoxia /reoxygenati on gr oup. I ntensity of each band was quanti 2fied by densit ometry, and data were nor malized by using the ac

21、tin signal . Contr ol gr oup was detected as a basal level (designated as 1 , and the others were exp ressed as folds compared with contr ol .2. 4ATRA 能逆转CO PP 诱导的HO 21过表达对照组HO 21蛋白表达水平很低, 缺氧/复氧组的HO 21蛋白表达水平较对照组略有增加(P 0105 ;而COPP 处理组的HO 21蛋白表达水平较缺氧/复氧F i g 2Expressi on of HO 21prote i n i n H9c2m yo

22、cytes of d i fferen t groups and the i r result ana lysis (珋x s, n =3组有明显增加(P 0101 。加入AT RA 后, HO 21蛋白表达水平大大的降低了, 见Fig 4。3讨论1:contr ol gr oup; 2:hypoxia /reoxygenati on gr oup; 3:COPP p retreat 2ment gr oup; 4:COPP +Znpp gr oup. 0105,3P 0105vs contr ol gr oup; P P 0101vs hypoxia /reoxygenati on gr o

23、up. I ntensity of each band心肌缺血/再灌注损伤是指在短时间心肌血供中断, 一定时间内恢复血供, 原缺血心肌发生较血供恢复前更严重的损伤7was quantified by densit ometry, and data were nor malized by using the actin signal . Contr ol gr oup was detected as a basal level (designated as 1 , and the others were exp ressed as folds compared with contr ol .。从

24、细胞水平进行心肌保护研究已成为近年来的热点, 其最大优点在于排除中国药理学通报Chinese Phar m acological B ulletin 2009Mar; 25(3 355了在体心脏模型中全身性神经因素和体液因素的影响, 以及离体心脏不同类型细胞间的相互作用8lar 家族的转录因子9, 10, 它在抗氧化反应元件。(ARE 介导的抗氧化基因表达中起重要的作用。因此, 本实验采用体外培养的H9c2心肌细胞作为观察对象, 研究COPP 预处理对心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用 。生理状态下它与胞质蛋白伴侣分子Keap1结合使活性处于相对抑制状态。在半胱氨酸残基发生氧化的情况下, N rf2

25、与Keap1解偶连后转移入核, 与ARE 结合, 启动ARE 调控的第相解毒酶及抗氧化酶基11因(如, HO 21 表达。有研究表明, AT RA 能抑制N rf22ARE, 它通过激活视磺酸(RA 的受体减少核中的N rf2与ARE 结合12示, 在N rf2蛋白表达很在核中的聚集, 进21过表达, 产生抗心肌细胞缺; AT RA 的加入抑制了N rf2在细胞核的聚集, 逆转COPP 诱导的HO 21过表达。这表明在H9c2心肌细胞中, COPP 预处理发挥抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用的机制与N rf22ARE 信号通路相关:COPP 预处理诱导N rf2在细胞核聚集增加, N rf2

26、结合到ARE 上, 从而启动ARE 调控的抗氧化酶基因HO 21的表达, 使HO 21表达增加, 发挥抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用(Fig 5 。但由于HO 21抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的机制和信号转导途径错综复杂, 有待于进一步的研究 。F i g 4Expressi on of H O 21prote i n i n H9c2m yocytes of d i fferen tgroups and the i r result ana lysis (珋x s, n =31:contr ol gr oup; 2:hypoxia /reoxygenati on gr oup; 3:COPP

27、 p retreat 2ment gr oup; 4:COPP +ATRA gr oup.3P 0105vs contr ol gr oup;P 0105, P 0101vs hypoxia /reoxygenati on gr oup.I ntensity of eachband was quantified by densit ometry, and data were nor malized by using the actin signal . Contr ol gr oup was detected as a basal level (designated as 1 , and th

28、e others were exp ressed as f olds compared with contr ol .CK 、LDH 是心肌细胞胞质中特异性酶。由于停灌/再灌所造成的心肌缺血/再灌注损伤使心肌细胞膜通透性增加, 心肌细胞内的一些重要酶如CK 、LDH 等大量的外漏, 因此测定CK 、LDH 外漏的程度F i g 5Protecti ve effect m echan is m of pretrea t m en t w ith CO PP aga i n st hypox i a /reoxygenati on i n jury of H9c2m yocytesCOPP 不是H

29、O 21的底物, 它不会被HO 21所降解, 因此, 它能不受阻碍地弥散停留在高活性的HO 21位点上, 有效地激活HO 21的表达。COPP 不仅是可间接反映心肌细胞的受损程度。本实验结果显示, 与缺氧/复氧组比, COPP 预处理使心肌细胞上清液的LDH 和CK 水平明显下降。这说明COPP 预处理具有抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用。HO 21抑制剂Znpp 的加入, 阻断了COPP 对心肌细至今发现的金属卟啉类的最有效的HO 21诱导剂, 而且在细胞内不会分解代谢生成活性氧族, 不会增加氧化应激6。因此, COPP 是诱导HO 21过表达的胞的保护作用, 这表明HO 21直接参与抗心

30、肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用。N rf2是一个具有碱性亮氨酸拉链的Cap n Col 2理想药物, 在缺血/再灌注损伤的防治上, 可能具有临床运用前景。总之, COPP 是很有前景的诱导HO 21过表达的356中国药理学通报Chinese Phar m acological B ulletin 2009Mar; 25(3N rf2in up 2regulati on of the heme oxygenase 21gene by cobalt p r o 2t opor phyrinJ .FASEB J , 2006, 20(14 :2651-3.7Schulze C J,W ang W ,

31、 Kumari R, et al . I n balance bet w een tissueinhibit or of metall o p reteinase 24and matrix metall o p reteinases during acute myocar 2dialcorrecti on of myocardial ische m ia 2reperfu 2si on injuryJ .C irculation , 2003, 107(19 :2487-92.8裴天仙, 徐长庆, 李鸿珠, 等. 槲皮素抗阿霉素诱导的培养心治疗药物。本实验研究显示, 在大鼠H9c2心肌细胞中,

32、 COPP 诱导HO 21过表达, 具有抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用, 其机制与N rf22ARE 信号通路相关。这为临床心肌缺血/再灌注损伤疾病治疗的新药研制提供了实验室依据。参考文献:1Anaya 2Prado R, T oledo 2Pereyra L H, Lentsch A B, et al . ischem i 2a /reperfusi on injuryJ .Surg Res , 2002, 105(2 :248-58. 2Cornelussen R N, Knowlt on A A. He me Oxygenase 21:versa 2tilesentinel agai

33、nst injuryJ .M ol Cell Cardiol , 2002, 34(10 :1297-300.3刘明, 赵晓宇, 周虹. 血红素加氧酶21肌细胞的凋亡J .中国药理学通报, 2008, 24(7 :534-8.8Pei T S, Xu C Q, L i H Z, et al . Effect of quercetin on rat cardi o 2myocyte apop t osis induced by adr ia myc in in vitro J .Chin Phar 2m acol B ull , 2008, 24(7 :534-9Moi P, Chan K, I

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36、:117-27.12W ang X J, Hayes J D, Henders on C J, et al . I dentificati on of retin 2oic acid as an inhibit or of transcri p ti on fact or N rf2thr ough activa 2ti on of retinoic acid recep t or al phaJ .Proc N atl Acad Sci , 2007, 104(49 :19589-94.中的保护作用J .生命的化学, ( -3L iu M , Zhao 1in ischem ia 2inju

37、ry.m L ife , 2004, 24(1 :50-2.4Masini E, Vannacci A, Marz occa C, et al . He me oxygen 2ase 21andthe ischem ia 2reperfusi on injury in the rat heartJ .Exp B iol M ed(M ayw ood , 2003, 228(5 :546-9.5刘明, 赵晓宇, 周虹, 等. 钴原卟啉诱导大鼠血红素加氧酶21适度过表达的研究J .医学分子生物学, 2005, 2(2 :79-82.5L iu M , Zhao X Y, Zhou H, et al

38、 . Op ti m um overexp ressi on of rathe me oxygenase 21induced by copp J .M ed M ol B iol , 2005, 2(2 :79-82.6Shan Y, Lambrecht R W , Donohue S E, et al . Role of Bach1andProtecti ve effect of CO PP on hypox i a /reoxygena ti on i n jury of H9c2m yocytesZHU Xiao 2jie, L IANG Fei,WANG Xiu 2hong, ZHAO W ei 2m ing, G AO Xu(D ept of B ioche m istry and M olecular B iology, Harbin M edical U niversity, Harbin 150086, China Abstract:A i m To study the