突变型p27基因治疗裸鼠大肠癌移植瘤的研究

1、突变型p27基因治疗裸鼠大肠癌移植瘤的研究         08-12-01 13:48:00     编辑：studa20                     作者：杜勇，徐少勇，杨建业，张丽摘  要  目的：研究外源性突变型p27(p27 mt)基因对

2、大肠癌的体内抑制作用。方法：应用细胞移植法把人大肠癌SW480细胞接种于BALB/c裸鼠皮下，构建大肠癌裸鼠模型，将腺病毒介导的突变型p27（Ad-p27 mt）及LacZ注射到瘤体内，绘制肿瘤生长曲线，计算肿瘤生长抑制率，并进行细胞凋亡及MMP9的相关检测。结果：Adp27 mt基因治疗组肿瘤生长明显受到抑制，MMP9的表达也明显较低，与LacZ、空白对照组比较，有显著性差异（P0.01）。结论：Adp27 mt基因对大肠癌裸鼠的体内肿瘤有明显的抑制作用，并能抑制MMP9。 关键词  腺病毒；p27 mt；大肠癌；裸鼠；MMP9Abstract:Objective To inves

3、tigate the inhibitory effect of adenovirus mediated p27mt gene tramsfer on xenograft of in colorectal carcinoma nude mice. Methods The xenograft model of colorectal carcinoma in nude mice was established by inoculating the SW480 cells of human colorectal carcinoma. Adp27mt and LacZ was injected into

4、 the tumors respectively. The growth curves and the growth inhibitory rates of tumors were analyzed and compared with control group.Apoptosis and matrix metalloproteinase9 (MMP9) were also detected .Results Adp27mt markedly suppressed the growth of tumors and promoted apoptosis of SW480 cells, which

5、 had a significant difference compared with control group(P<0.01),and MMP9 expression was lower in Adp27mt group than Lacz group and control group. Conclusions Adp27mt has obviously inhibitory effect on the tumor growth of colorectal carcinoma in nude mice in vivo.Key words:Adenovirus p27mt;Color

6、ectal carcinoma;Nude mice;MMP9正常情况下p27基因在G0/G1期表达增高，当细胞进入S期则表达下降。p27基因高表达抑制细胞增殖是一个普遍现象。将外源性p27基因导入细胞内造成p27蛋白高表达，可使细胞DNA合成强烈受抑制，细胞中止于G1期而停止增殖1。把苏氨酸187换成蛋氨酸187，称为突变型p27 mt，其比体内天然存在的p27有更强的抗肿瘤作用。1  材料和方法1.1  材料SPF级BALB/c裸鼠购自湖北省实验动物中心，雌雄兼用，大肠癌SW480细胞购自第四军医大学细胞库，独立送回风动物饲养笼具(IVC笼具，苏杭动物实验器材公司)，pO

7、RF9hp27 mt质粒购自Invivogen 公司，腺病毒骨架质粒pAdeasy1，质粒pShuttleCMV,pBluesciptSK(+)，Ad293细胞，大肠杆菌BJ5183和XL10gold购自Stratagene公司，DH5由郧阳医学院临床医学研究所保存；Age，Nhe，Kpn，Not，Pac和Pme购自New England Biolabs公司，Hind ,EcoR，DNA Hind marker,200 bp DNALadderdNTP，Taq酶和T4 DNA 连接酶购自华美生物公司,hp27 mt 引物由北京赛百盛生物公司设计合成；DMEM购自Gibco公司，CsCl购自Si

8、gma公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。所用试剂AntiMMP9为鼠抗人单克隆浓缩型抗体,浓缩型免疫组化SP试剂盒、DAB 显色试剂盒、胃蛋白酶和胰蛋白酶均购于福建迈新公司。1.2  方法1.2.1  人大肠癌裸鼠模型的构建：重组腺病毒载体构建、鉴定、扩增见相关文献23。取大肠癌SW480细胞加入DMEM培养液中置37 ,50 ml/L CO2培养箱中培养、传代，反复传代至75 cm2培养瓶共36瓶，取对数生长期的SW480细胞经2.5 g/L胰蛋白酶消化后抽取100 l，释稀后应用台盼蓝染色确定细胞活力大于99%后，收集36瓶75 cm2培养瓶中细胞并调整

9、细胞浓度为1×108/L的细胞悬液，每只按0.2 ml接种于4周龄BALB/c裸鼠右侧背部皮下，共36只，接种后饲养于我院临床医学研究所动物实验中心SPF实验室IVC笼具内，裸鼠所用饲料、水及用具均经灭菌处理后于超净工作台内更换，肿瘤潜伏期710 d，至2周时肿瘤基本均长至0.410 cm左右，去除个体肿瘤差异较大的裸鼠，选用肿瘤介于0.5 cm左右裸鼠27只，随机分为3组，每组9只，分为空白对照组、LacZ组及p27 mt组，采用肿瘤局部直接注射法，对照组中每只瘤体内注射PBS 0.1 ml,LacZ组为LacZ 0.1 ml(病毒含量1010pfu)，实验组每只注射Adp27 m

10、t（病毒含量1010pfu）0.1 ml，3 d 1次，共3次，每3日测量肿瘤最长径（A），最短径（B）一次，并根据公式V=/6（A+B）/23计算体积，4 周后断颈椎处死动物，剥离肿瘤，称质量并绘制肿瘤生长曲线，按公式肿瘤生长抑制率(%)=(对照组肿瘤质量实验组肿瘤质量)/对照组肿瘤质量×100 %，计算肿瘤生长抑制率。1.2.2  细胞凋亡检测：无菌剥离肿瘤后用PBS漂洗3次，去除表面血污及脂肪、结缔组织后，切割成1 mm3大小的碎块，装入试管中，加入30倍体积0.5 g/L胶原酶，置37 水浴中消化60 min，间断振荡数次，终止消化后，用100目网眼的筛网过滤，去除

11、未消化组织，收集细胞悬浮于离心管中，1 200 r/min离心5 min，去上清液，用PBS漂洗、离心，800 r/min，3 min，共两次，以除去细胞碎片，用300目筛网过滤，去除粘连细胞，用PBS调整细胞密度至1×108/L，加入DNA结合性荧光染料PI染液（50 mg/L）1 ml，染色30 min，流式细胞仪检测瘤细胞DNA含量及G1/GO期、G2/M期，S期百分数，检测时每个样品测5 000个细胞，其荧光信号经流式细胞Multicycle细胞周期分析软件处理后以直方图和数据表方式显示。1.2.3  MMP9免疫组化检测：采用SP 法,按说明书步骤进行。1.2.4

12、  结果判断：低倍镜(×40)下找到癌巢周边基质区域,高倍镜(×200)下 每张载玻片计数5个视野，计数每个视野中癌细胞总数及MMP9表达阳性的癌细胞数。免疫组化MMP9 表达强度根据阳性物质胞浆棕黄色着色深浅及阳性细胞数的百分比分为4级:(-)阳性细胞数小于5%；(+)阳性细胞数在5%25%之间；(+)阳性细胞数在26%50%之间；(+)阳性细胞数在50%以上。1.3  统计学处理应用SAS统计学软件，组内两两比较应用t检验，组间比较应用重复观测资料的2分析。2  结果2.1  对大肠癌裸鼠模型的抑制作用应用细胞接种法接种后，肿瘤生长潜伏期710 d，14 d肿瘤平均体积0.5 cm3(0.48±0.23)左右，生长较为均一，动物生长状况良好，连续治疗观察4周，动物无死亡。 肿瘤生长曲线（图 1）：组间比较p27 mt组与对照组、LacZ组有显著性差异(P0.01），空白对照组与LacZ组无统计学差异（P0.05）。2.2  肿瘤生长抑制率28 d后断颈椎处死动物，无菌剥离肿瘤，称瘤质量，抑瘤率38.2%(表1)， p27 mt组与对照组、L