肿瘤浸润性淋巴细胞结合偶联半乳糖抗CD3单克隆抗体的肝脏靶向性研究

1、    肿瘤浸润性淋巴细胞结合偶联半乳糖 抗CD3单克隆抗体的肝脏靶向性研究        【摘要】目的探讨结合偶联半乳糖(Galactose，Gal)抗CD3单克隆抗体(Anti-CD3-McAb)肿瘤浸润性淋巴细胞(Tumor infiltrating lymphocytes，TIL)肝脏靶向性。方法本组把大鼠抗小鼠CD单克隆抗体和半乳糖偶联在一起,与3H-TdR标记TIL结合后，从鼠尾静脉注入小鼠体内，在注射不同时间眼眶取血0.5ml，然后处死，切除肝、脾、肺

2、，分别称重后进行放射性强度测定。结果结果显示：注射Gal-anti-CD3-McAb-TIL小鼠肝脏比注射单纯TIL的小鼠肝脏具有较高的放射性(P<0.01)，且该放射性持续较长一段时间，而脾、肺、血液内放射性强度差异无显著意义(P>0.05，P>0.05，P>0.05)。结论该结果提示：Gal-anti-CD3-McAb-TIL较单纯TIL具有更好的肝脏靶向性。【关键词】肝肿瘤抗体，单克隆载体蛋白质淋巴细胞，肿瘤浸润半乳糖 The hepatic-targeting tendency of tumor infiltrating lymphocyte (TIL) com

3、bined by Gal-anti-CD3 Monoclonal antibodyBA MingchenHE ShengZHANG Chongjieet al.Department of Hepatobiliary Surgery,Kunming General Hospital, Chengdu Military Region， Kunming650032【Abstract】ObjectiveTo investigate the hepatic-targeting tendency of the TILs from rat of liver cancer (LC) combined by G

4、al-anti-CD3-McAb.Methods TILs (Labeled3H-TdR) from rat of LC were conjugated with Gal-anti-CD3McAb and TILs (Labeled 3H-TdR) alone were infused intravenously into rat body in two groups.At different time intervals,blood was sampled from eye socket.Rats were then sacrificed,and the livers, spleens an

5、d lungs were excised, weihged, and radio activities measured. ResultsIt was found that the liver radio activities in the rats infused TILs combined with Gal-anti-CD3 McAb were much stronger and longer lasting than those infused TILs alone (P<0.001).The radio activities in lung,spleen and blood we

6、re not statistically different from each other (P>0.05, P>0.05, P>0.05).ConclusionThis result suggests that TILs combined with Gal-anti-CD3 McAb have much better hepatic-targeting tendency than TILs alone.【Key words】Liver neoplasmsAntibodies,monoclonalCarrier proteins Lymphocytes,tumor-infi

7、ltratingGalactose只存在于哺乳动物体内肝细胞表面的肝结合蛋白(hepatic binding protein，HBP)是血浆中无唾液酸糖蛋白的受体，偶联了半乳糖的抗CD3单克隆抗体(Gal-anti-CD3-McAb)是血浆中无唾液酸糖蛋白的类似物，具有肝脏靶向性1。本组拟对Gal-anti-CD3-McAb-TIL的肝脏靶向性进行探讨。材料与方法一、TIL制备及3H-TdR标记取昆明种小鼠动物瘤株8只，断椎处死，切取肿瘤组织，采用Rosenberg法分离TLL、培养、扩增2。取培养TIL2.0×108，加3H-TdR2.22×107Bq(比活性600uCi

8、),在含rIL-2培养基中置375%（1500）CO2孵箱中孵育15小时，计算TIL标记率。二、制备Gal-anti-CD3-McAb参照庞其捷等3报道的方法,以半乳糖为原料，合成双功能试剂IME-硫代半乳糖苷，与Anti-CD3-McAb偶联后，进行分离、纯化、糖密度测定。三、TIL结合Gal-anti-CD3-McAb结合率检测取TIL2.5×107加入Gal-anti-CD3-McAb30g,在培养基中孵育1.5小时，加入荧光标记羊抗大鼠IgG60g，孵育2小时，洗脱，生理盐水调至3ml，涂片，荧光显微镜下计数2个视野总细胞数和荧光标记TIL细胞数，计算TIL细胞的荧光标记率即

9、是。四、TIL在小鼠脾、肺、肝、血内分布测定将标记3H-TdR的TIL2.0×108平均分成A、B两份，A份加入Gal-anti-CD3-McAb120g,培养基中孵育2小时，洗脱，生理盐水分别调至4ml；取相同昆明种小鼠24只，随机分为A、B两组，每组各取相等1或2只配对，A组每只从鼠尾静脉注入A种单细胞悬液200l，B组注射B种单细胞悬液200l，分别在注射后1、4、8、12、24、48、72小时，取配对A、B组小鼠，抠眼取血0.5ml，断椎处死，切取肺、脾和部分肝脏(约250mg)，洗涤、揩干、称重、充分消化，闪烁仪测定放射性强度，结果以CPM计。结果1.8只昆明种小鼠动物瘤株

10、共切取肿瘤组织10g，分离TIL3×106，培养2周后扩增至6.5×108，TIL3H-TdR标记率为74%（74100）。TIL结合Gal-anti-CD3-McAb的结合率为85%（85100）。2.在注射1小时后，A、B两组小鼠每单位重量样品的CPM均最高，在同一只小鼠体内，每单位重量样品的CPM以肺为最高，肝、脾次之，血液最低；注射4小时后，肺脏每单位重量样品的CPM逐渐减少，肝、脾每单位重量样品的CPM逐渐增多，仍以外周血为最少；在注射8小时后，A组小鼠单位重量肝脏标本CPM稳定在一定范围内，且持续较长一段时间，而B组小鼠却逐渐减少。由于小鼠单位重量样品相对放射性

11、强度测定CPM值不成正态分布，将其换算为常用对数，配对资料t检验处理。结果显示：A、B两组小鼠每毫克肝脏标本CPM值差异有显著意义，而肺、脾及血液的两组差异无显著意义。详见表1。表1小鼠24只每单位重量样品相对放射性强度测定值对数值(单位:CMP Paired t-Test)组别脾肺肝血A0.65430.97860.67850.4975B0.65280.97690.38430.4784t值0.04280.60786.35291.1304P值>0.05>0.05<0.001>0.05讨论 Stokert等研究证明，只存在于哺乳动物体内肝细胞表面的HBP是血浆中无唾液酸糖蛋

12、白的受体，分布在血窦一侧的肝细胞膜上，HBP能识别分子末端带有Gal残基的糖蛋白并与之结合，形成配体受体复合物，经微观簇集而内陷化进入胞浆，二者解离后，受体再循环至细胞膜，配体或被溶酶体酶分解或随胆汁排出4。据此，我们把Gal与Anti-CD3-McAb偶联，与TIL结合后注入小鼠体内，以提高TIL在肝脏内的分布，增加TIL抗肝癌特异性。作为免疫球蛋白的一种，抗CD3单克隆抗体含赖氨酸、精氨酸达10%(1/10)以上5，这些碱性氨基酸易于和Gal偶联；TIL作为新一代抗肿瘤效应细胞，其细胞毒活性是LAK细胞的50100倍2，在TIL中，CD3T细胞约占7080%（710810）6，易于和Gal

13、-anti-CD-McAb结合，且该McAb能增加TIL对IL-2的敏感性，促进TIL的增殖，增加TIL的抗肿瘤效应7。多数学者研究证实，TIL能够靶向性地在肿瘤周围聚集，具有抗肿瘤特异性。但是，由于TIL是效应细胞，个体较大，从外周静脉输入，即使从肝脏动脉插管输入，进人肝脏与肿瘤细胞接触，需经过许多生理屏障，易于在肺、脾及外周淋巴结内聚集，到达肝脏的相对较少8。TIL只有到达肝细胞间隙，经过较长时间的停留，受肿瘤特异性抗原及其产生的化学介质趋化作用，才能特异性地向肿瘤组织移动，聚集在肿瘤部位，发挥更好的抗肿瘤效应。本组采用药物化学、分子生物学方法，把TIL和Gal-anti-CD3-McAb

14、结合在一起，既增加了TIL的肝脏靶向性和TIL在肝脏组织中的相对数量，又能提高TIL在肝脏内的增值，提高TIL的抗肿瘤效应，为肝癌的生物导向治疗和靶向性基因治疗提供了新的方法。作者单位：650032成都军区昆明总医院肝胆外科(巴明臣)；华西医科大学第一临床医学院肝胆胰研究室(何生)；基础医学院免疫研究室(章崇杰，赵宗荣)；药学院药化教研室(庞其捷，宋志平)参考文献1Stokert RJ，MoreIi AG.Hepatic binding protein：Thegalactose-specific receptor of mammalian hepatocytes.Hepatology，1983

15、,3:750-757.2Rosenberg SA, Spiess P,Lafreniere R. A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor-infiltrating lymphocytes.Science,1986,233:1318-13213庞其捷，杨麟，钟裕国，等半乳糖基新糖白蛋白的制备及其对肝特异性受体结合试验的研究华西医科大学学报,1991,22:368-3714Steer CJ, Ashwell GStudies on a mammalian hepatic binding protein sp

16、ecific for asialoglycoproteins. J Biol Chem, 1980,255:3008-30135王亚辉主编分子免疫学北京：北京科学技术出版社,1982200-2016王一,宝建中,陈汉，等人肝癌TIL体外抗瘤活性及其表型特征的研究肝胆外科杂志，1995,3:42-447Schoof DD, Selleck CM, Massaro AF, et al.Activation of human tumor-infiltrating lymphocytes by monoclonal antibodies directed to the CD3 complex. Cancer Res,1990,50:1138-